（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ（ＦＦＡｓ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｉｍｅ－ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｇ（＞ＴＯＦ—ＭＳ）． Ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ
ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ｂ．ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ
ｆａｔｔｙ
ａｃｉｄ
ｍｅｔｈｙｌ答ｔｅｒ
ａｎｄ
ｈｕｍａｎ辩ｒｕｍ
ｅｓｔｅｒｓ（ｔａｂｌｅ １）；
ａ．ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｅ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙＩ ｃ．ｔｈｅ
ｅｓｔｅｒ
ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ［ａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ
收稿日期：２００８—０８—２７；修回日期：２００８—１２—２５ 作者简介：李海静（１９７８～），女（汉族），山西大同人，硕士研究生，从事生物医学分析研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｘｕｌｍ２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃ１１ 通信作者：董方霆（１９６６～），女（汉族），上海人，研究员，从事生物医学分析研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｆｔ＠ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ｃｎ
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图１标准溶液及人血清总离子流色谱图
ａ．十七烷酸甲酯溶液；ｂ．脂肪酸甲酯混合标准溶液（表１），Ｃ．未衍生化的人血清脂肪酸｝ ｄ．三氟化硼一乙醚／甲醇衍生化的人血清脂肪酸；ｅ．硫酸／甲醇衍生化的人血清脂肪酸（表２） Ｆｉｇ．１ ＴＩＣ ｏｆ ｔｈｅ
顺一５，８，１１，１４，１７－二十碳五烯酸甲酯（Ｃｚｏ．５） 顺一８，１１，１４一二十碳三烯酸甲酯（Ｃｚｏ。３） 顺－１１，１４－一－－十碳二烯酸甲酯（Ｃｚｏ。２） 顺一１１＿二十碳烯酸甲酯（ｃ２０。１）
花生酸甲酯（Ｃｚｏ．ｏ） 二十一酸甲酯（Ｃ２１．ｏ） 顺一１３，１６一二十二碳二烯酸甲酯（Ｃｚｚ。２）
但三氟化硼一乙醚／甲醇溶液衍生化步骤较多，脂
１．３．２质谱条件
电子轰击（Ｅ１）离子源，电子
能量７０ ｅＶ，传输线温度２５０℃，离子源温度２２０ ℃，电离方式ＥＩ＋，质量扫描范围ｍ／ｚ ５０－－８００。 １．４样品前处理
１．４．１未衍生化取２００肚Ｌ正常人血清，加入 １６肚Ｌ内标十七烷酸酯甲醇溶液（１ ｇ・Ｌ－１），混
完成，利用硫酸／甲醇溶液衍生化可得到约２０种Ｃ，：～ｃ：。脂肪酸的理想分离。建立了人血清ＦＦＡ的气质联 用分析法，为脂肪酸相关性疾病的研究提供了新的简洁、快速、高效、安全的方法，并可获得大信息量的技术 支持。
关键词：游离脂肪酸（ＦＦＡｓ）；人血清；气相色谱一飞行时间质谱（ＧＣ－ＴＯＦ—ＭＳ）；衍生化
中图分类号：Ｏ ６５７．６３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－２９９７（２００９）０２—８３—０５
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ｂｙ ＧＣ＿－ＴＯＦｌ－ＭＳ
ＬＩ Ｈａｉ－ｊｉｎｇ，ＷＵ Ｓｈｅｎｇ—ｍｉｎｇ，ＦＡＮＧ Ｊｕｎ－ｊｉａｎ，ＬＩ Ｙｕ，ＭＡ Ｋｕｎ—ｐｅｎｇ， ＳＯＮＧ Ｚｈａｎ－ｊ ｕｎ，ＤＯＮＧ Ｆａｎｇ—ｔｉｎｇ
匀，然后加入４００ ｐＬ氯仿和８００ ｐＬ甲醇，振荡
２
肪酸损失严重，回收率较低（列于表３）。相比较 而言，硫酸／甲醇衍生化可满足脂肪酸谱分析所 要求的信息量大、高效、低毒、操作简单等各项
要求。
ｍｉｎ，再加入４００“Ｌ氯仿，振荡３０ Ｓ，最后加入
Ｓ，１２ ０００
４００＿ｕＬ水，振荡３０
后进样分析。
ｒ・ｍｉｎ叫离心１０
十四酸甲酯（Ｃ…ｏ） 顺一１０一十五碳烯酸甲酯（Ｃ１ ５。１）
十五酸甲酯（Ｃ１ｓ。０） 棕榈油酸甲酯（Ｃ１６．１）
棕榈酸甲酯（Ｃ…０） 顺一１０一十七碳烯酸甲酯（Ｃ１７．１）
名称 反油酸甲酯（Ｃ１８ｔ１）
名称
辛酸甲酯（Ｃｓ．ｏ）
峰序号
１７ １８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１
癸酸甲酯（Ｃ…ｏ）
十一酸甲酯（Ｃ１１。ｏ） 月桂酸甲酯（Ｃ１２．ｏ） 十三酸甲酯（Ｃ１３．ｏ） 十四碳烯酸甲酯（Ｃ“．Ｉ）
硬脂酸甲酯（Ｃ…ｏ）
花生四烯酸甲酯（Ｃ２０，４）
ｍｍ×０．２５ ｔｉｍ）；Ｍａｓｓｌｙｎｘ ｍＸ０．２５
三氟化硼一乙醚／甲醇衍生化
取２００
弘Ｌ正常人血清，加入１６弘Ｌ内标十七烷酸酯甲 醇溶液（１ ｇ・Ｌ－１），混匀，加入８００弘Ｌ甲醇，充 分混匀，再加入１．６ ｍＬ氯仿，振荡混匀后，３
０００
ｒ・ｍｉｎ－１离心１０ ｍｉｎ，取下层萃取液，４０℃氮气
ｔｏ ｔｏ
ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ ＦＦＡｓ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｏ—
ｔｈｅ ｓｉｍｐｌｉｆｙ，ｒａｐｉｄｉｔｙ，ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｅｎｏｒｍｏｕｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ（ＦＦＡｓ）；ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ；ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｉｍｅ—ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ
２结果与讨论
用上述样品的处理方法及检测条件分别分 析空白对照，标准溶液（图ｌａ、ｌｂ）及样品提取液
色谱条件
色谱柱：ＤＢ一５ＭＳ（３０
ｍ×
（图１ｃ、１ｄ、ｌｅ）。由结果可知：十七烷酸酯在
１８．７
ｌｕｍ）；升温程序：柱初温５０℃， 以３０℃・ｍｉｎ＿１升温至１６０℃，保持１ ｍｉｎ，以４ ℃・ｍｉｎ－１升温至２４０℃，保持１ ｍｉｎ；以３０ ℃・ｍｉｎ－１升温至２８０℃，保持３ ｍｉｎ；进样温度 ２６０℃；载气为Ｈｅ；柱流量（恒流）：１
ｅｓｔｅｒ
ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ
ａｓ
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ．Ａｆｔｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ
ｅｓ—
２．５％Ｈ２ Ｓ０４／ｃＨ３ ＯＨ，ｔｈｅ ＦＦＡｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ
ｔｅｒｓ，ａｎｄ Ｎ—ｈｅｘａｎｅ ｗａｓ ａｄｄｅｄ
ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣＩ．ＴＯＦ—ＭＳ）；ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ
游离脂肪酸（ｆｒｅｅ
ｆａｔｔｙ
ａｃｉｄｓ，ＦＦＡｓ）是指非
及内分泌代谢的影响。随着研究的深入和技术 的不断进步，血清ＦＦＡｓ与疾病的关系逐渐明 晰，ＦＦＡｓ已被证实与心脑血管‘¨、呼吸、消化、
酯化的脂肪酸或未脂化的脂肪酸。血清中的 ＦＦＡｓ代谢活性极高，极易受脂肪代谢、糖代谢
ｍｉｎ～；进样量０．３ⅡＬ。
ｍＬ・
ｍｍ×０．２５ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ｍｉｎ出峰；脂肪酸酯的混合标准品可检测
到３１种脂肪酸酯（图１ｂ，具体的脂肪酸酯列于 表１）；不经过衍生化时，可检测到的脂肪酸数量 很少，不适合脂肪酸谱的分析，尤其是对于以此 为基础的脂质组学研究，更显得价值不大。实验 表明，对样品进行酯化处理是必要的。 由图１ｄ、１ｅ可知，三氟化硼一乙醚／甲醇溶液 和硫酸／甲醇溶液作为衍生化试剂时，均可得到 较多的脂肪酸类物质信息，包括Ｃ，：～Ｃｚ。的多种 饱和及不饱和脂肪酸（具体的脂肪酸列于表２）。 这２种方法所得的脂肪酸种类未见有明显差别，
ｍｉｎ，取下层氯仿，氮气吹干，用４０“Ｌ甲醇溶解
万方数据
第２期
李海静等：气质联用法测定人血清游离脂肪酸
８５
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；茎量
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１瓤０。孰１６１８ ２濮０ ２２‰蛾。ｂ
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装
ｊ １００ 芒 昌５０ 量
吹干，残渣加入４００“Ｌ Ｖ（三氟化硼一乙醚）：Ｖ
（甲醇）一３：１的溶液，７５℃水浴加热３０ ｒ・ｍｉｎ－１离心５
ｍｉｎ，
取出放至室温下冷却，加入２００弘Ｌ水和６００弘Ｌ
正己烷，振荡混匀，３
０００
ｍｉｎ，
取上层正己烷，氮气吹干，用４０“Ｌ甲醇溶解后 进样分析。 １．４．３硫酸／甲醇衍生化取２００扯Ｌ正常人血 清，加入１６＿ｕＬ内标十七烷酸酯甲醇溶液（１ Ｌ－１），混匀，加入１
ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ
ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｅｘｔｒａｃｔ
ｗａｓ ｐｅｒ—
ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＧＣ—ＴＯＦ—ＭＳ．Ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ
ａｒｅ
ｎｏｎ—ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．Ａｔ ｌｅａｓｔ ２０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ＦＦＡｓ（Ｃ１２一Ｃ２４）ｉｎ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉＳ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ３３ ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｉｃｓ ｄｕｅ
万方数据
８４
质谱学报
１．４．２
第３０卷
内分泌、免疫等系统疾病的发生发展，以及肿瘤 和创伤性应激等［２ｑ］的能量代谢关系密切。尤其 是多不饱和脂肪酸，已成为脂肪酸相关性研究的 焦点。因此，人体血清ＦＦＡｓ的定性、定量及快 速测定，对医学基础研究及临床检验均具有重要 的意义。对血清ＦＦＡｓ谱的综合分析将有助于 深入揭示不同脂肪酸之间的相关性，进一步阐明 脂肪酸与疾病预防和治疗的关系，为寻找潜在的 异常代谢途径或致病机制提供科学依据。 本研究对人血清ＦＦＡｓ提取及衍生化方法 进行筛选和优化。 试验部分 气相色谱一飞行时间质谱仪（ＧＣ—ＴＯＦ—ＭＳ）： 美国Ｗａｔｅｒｓ公司产品；Ｄ昏５ＭＳ柱（３０