牧草育种中多倍体诱导方法研究进展刘芳1，侯建华1，*（1.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特010010；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特010010）摘要:主要介绍了牧草育种中化学和组织培养方法诱导染色体加倍的研究进展，并提出其发展趋势。
关键词:牧草育种；染色体加倍；秋水仙素；除草剂；组织培养中图分类号：文献标识码：A多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。
多倍体多个染色体组所产生的累积效应使其生物量、矿物质及营养成分增加，在性状上表现为叶大、花大、茎粗、色深、细胞内某些物质含量较高以及植株的生态适应力和抗逆性增强[1]。
多年来，人工诱导多倍体的研究一直吸引着广大植物育种工作者。
在众多的多倍体诱导方法中，秋水仙素诱导法效果理想、操作简单、成本也相对较低。
秋水仙素被认为是使用最广泛的植物加倍化学药剂[2]。
氨磺乐灵(Oryzalin)、甲酰胺草磷(Amiprophose methyl,APM)和氟乐灵(Trifluralin)等除草剂对一些植物中的离体多倍体诱导程度比秋水仙素高，药害程度比秋水仙素轻微，其应用范围正在扩大。
而随着植物组织培养技术的发展，化学药剂可以在离体条件下诱导单个细胞染色体加倍，获得多倍体再生，克服常规人工加倍处理方法的缺陷。
1 化学方法，1.1 秋水仙素在化学加倍法中的应用江西省畜牧技术推广站从伯克（Birca）多花黑麦草中优选单株，用秋水仙素使染色体加倍后，又经60Co射线辐射种子，选育出四倍体赣选1号多花黑麦草[3]。
冰草中同源多倍体比较普遍，将二倍体诱导成四倍体是易于成功的，再把诱导成的四倍体与天然四倍体杂交，是冰草中最有前途的远缘杂交策略。
冰草杂交品种Hycrest就是由诱导的四倍体冰草与天然的四倍体沙生冰草杂交获得[4]。
羊茅黑麦草种群的染色体加倍通常也采用秋水仙素的加倍方法[5]。
这一工作既可在杂交前进行，也可在杂交后进行。
通过种间杂交辅之以染色体加倍，人们现已从羊茅黑麦草种群中获得如下3 个模式品种：(1) 黑麦草杂种品种。
将二倍体的多花黑麦草和多年生黑麦草先加倍后杂交，然后从杂种后代中选出品种。
(2) 羊茅的双二倍品种。
这是高羊茅欧洲型与地中海型间的杂种，由于这两个地理上远缘的品系相互杂交后F1 代植株完全不育，最终只能借助于染色体加倍恢复并提高育性。
(3) 羊茅—黑麦草间的杂种品种。
现在生产上所用的此类品种大都是将多花黑麦草与草地羊茅预先加倍后再杂交育成的。
各种因素对秋水仙素诱导效果的影响都有过报道[6-12]，包括方法、材料、浓度、时间、温度及恢复期温度等，同时预处理[13]和某些辅助剂[8，14，15]的影响也被探究过。
在实体人工加倍处理法中，普遍采用浸种法、注射法、涂抹法及包埋法，其中秋水仙素水溶液直接浸泡种子的方法成功地在菊花[9]、君子兰[16]、油菜[17]等植物上诱导出了多倍体，但其有效诱导效率低，而且秋水仙素用量太大，毒害作用最为直接，同时材料也可以因缺氧而死亡[18]。
1997年郭立华、*通讯作者：侯建华(1962-),女，内蒙古人，教授，硕士生导师，主要从事植物遗传育种。
Email:Houjh68@作者简介：刘芳（1982- ），女，内蒙古人，在读研究生，研究方向为牧草遗传育种。
云锦凤等采用秋水仙素处理萌动种子的方法，对蒙古冰草（2n=14）的诱变效应进行了研究。
结果表明：染色体加倍植株皆为二倍体和四倍体的混倍体；加倍植株在发育初期生长缓慢，其分蘖数和株高分别为对照二倍体植株的47.76%和72.83%；适宜处理浓度和时间分别为0.01～0.075%和2～6h。
张秀丽[16]将山丹新麦草萌动种子用秋水仙素浸泡处理后其幼苗的变异主要表现为：胚芽鞘膨大呈棒状，幼根尖端肿大呈鼓锤状或圆球状。
在秋水仙素浓度0.2％，4h的处理时间下，幼苗诱变率最高，为14.3％。
张秀丽还对由新麦草成熟胚培养的再生小植株用浸泡法进行了染色体加倍处理，秋水仙素溶液浓度0.20％，植株的成活率8.60％，四倍体诱变率为33.33％。
用注射器将秋水仙素注入生长点的方法缺点在于针头易刺伤生长点，而造成生长点霉烂死亡，诱导效率低。
涂抹生长点方法处理时虽然可以避免对生长点的机械损伤，死亡相对少一些，但难使药剂与生长点完全接融[20]。
而用脱脂棉包埋生长点或胚芽则较好的解决了上述问题，在生姜[18]、成龄桑[20]上均获得了较好的效果。
除了以上四种方法，更多牧草育种工作者采用浸泡分蘖芽的方法。
马艳红[21]以加拿大披碱草×野大麦杂种F1代为试验材料，用秋水仙素浸泡法处理其分蘖苗。
秋水仙素浓度在0.15%～0.20%、处理时间为12～24h，诱变效果最好。
王树彦[22]等将加拿大披碱草与老芒麦种间杂种F1代潜伏秋分蘖芽用秋水仙素溶液避光室温浸泡处理，然后移栽到田间。
在生长过程中，部分处理植株的株高分别经历了1次低落，然后逐渐恢复生长，说明该处理植株受到诱变剂的严重影响，很可能形成了变异嵌合植株，经过严酷的生长竞争，变异的嵌合细胞被淘汰，正常的细胞逐渐恢复了生长。
该试验没有加倍成功的植株。
人们在研究中发现，在实体人工诱导加倍中，秋水仙素作用的主要对象是生长点，只有生长点的细胞全部加倍，才能获得加倍成功的植株，但这种几率很小，由此获得加倍材料多为嵌合体，往往不能稳定遗传，而且受环境干扰大，并且可能产生回复突变[23]。
1.2 除草剂在化学加倍法中的应用植物染色体加倍大多是通过使用秋水仙素(Colchicine)来实现的，但仍然存在一些缺点。
为了寻找更加有效的诱导剂，国外已经做了大量的研究。
研究表明，除草剂如氨氟乐灵(Pronamide)、氨磺乐灵(Oryzalin)、甲酰胺草磷(Amiprophose methyl,APM)和氟乐灵(Trifluralin)，对一些植物中的离体多倍体诱导程度比秋水仙素高，药害程度比秋水仙素轻微，除草剂类药剂的应用也在扩大。
磷酰胺类除草剂和二硝基甲苯类除草剂对植物微管蛋白的亲和力要比秋水仙素高, 在低浓度条件下具有比秋水仙素更高的微管蛋白解聚能力。
在玉米和小麦中，抑制微管蛋白的有效浓度，秋水仙素是除草剂的100 或1 000 倍以上[24]。
不同的植物材料, 甚至同一材料不同的取材部位, 对离体染色体加倍影响较大。
目前国内外报道的用于除草剂诱导的植物体材料主要有芽、子叶及子叶下胚轴、种子、茎尖和胚等，其诱导效果完全不同。
以一些植物的芽作为外植体[25]，除草剂的诱导浓度影响芽再生、多倍化程度以及再生植株成活率。
和秋水仙素一样，除草剂浓度越高，处理时间越长，对植物组织的抑制程度越大，抑制过大，植株生长缓慢甚至死亡。
反之，诱变效果不明显。
因此，选择合适的浓度和处理时间对诱导染色体加倍至关重要。
多年生暖季型牧草，Eastern gamagrass (Tripsacum dactyloides) （鸭茅状摩擦禾）[26]，用10、15、20μM AMP处理其芽3-5天后，有14个植株为4倍体。
这些植株形态正常且能生产完整饱满的种子。
流式细胞仪和染色体计数表明，其诱导后代具有四倍体重现性。
一般认为，对具体材料而言，浓度高时，处理时间短；浓度低时，处理时间长。
且除草剂的处理时间在不同植物中不同。
2 组织培养加倍技术2.1用秋水仙素溶液处理培养材料随着植物组织培养技术的发展，使得秋水仙素可以在离体条件下诱导单个细胞染色体加倍，获得多倍体再生，克服常规人工加倍处理方法的缺陷。
离体培养加倍法从已有的报道来看，离体条件下染色体加倍的途径有两条，一是先用秋水仙素溶液处理培养材料，然后转入分化培养基[14,27]；二是在含秋水仙素的固体培养基培养一段时间，诱导加倍[28]，再转入分化培养基。
近年来研究发现，离体培养条件下染色体加倍具有试验条件容易控制；试验结果重复性强；工作效率高；嵌合体发生率低等明显的优势。
因此，用秋水仙素进行离体组织的染色体加倍，尤其是第二条途径日益受到重视。
Novak 早在1983年用3%秋水仙素+4%的DMSO采用上述两种方法处理大蒜茎尖，两种方法的诱导率分别为6.25 %、24.32 %[29]。
向齐君（1994）在液体培养基上用0.05%的秋水仙素处理小麦—黑麦杂种幼穗愈伤组织，再生植株的育性得到有效的恢复，48.1%的穗子结实，5.2%的穗子结实率达到34.8%。
马艳红[21]以加拿大披碱草×披碱草杂种F1和加拿大披碱草×圆柱披碱草杂种F1为试验材料，取胚性愈伤组织，分别接种在含秋水仙素的诱导愈伤培养基上进行处理，之后分化成苗。
处理后，不同浓度秋水仙素处理后其愈伤分化率变幅在17.50%～66.25%，且出现变异植株，其中，加拿大披碱草×披碱草杂种F1在秋水仙素处理浓度为150mg/L、处理时间为48h时，变异率最高，为12%；加拿大披碱草×圆柱披碱草杂种F1在秋水仙素处理浓度为200mg/L、处理时间为16h时，变异率最高，为10%。
张颖[30]等羊草×灰色赖草杂种F1细胞悬浮系建立后加入秋水仙素（2%二甲基亚砜）振荡处理，再分化成苗。
其中0.03%处理24h、72h绿芽率分别为27.8%、72%，出苗率均为5.6%。
而其他处理的出苗率均为0。
张秀丽[19]在山丹新麦草多倍体诱导研究中指出：0.2％的秋水仙素处理30d的愈伤组织其四倍体诱变频率最高，为50.0％。
以0.2％秋水仙素处理再生小植株5h的效果最好，成活率6.8%，四倍体诱变率为33.33％。
王树彦[21]以加拿大披碱草与老芒麦种间杂种F1代为试验材料将F1代愈伤组织（5mm大小）继代于含0.2%秋水仙素的培养基上，直至分化成苗。
与常温相比，4℃低温处理2d至7d,对愈伤组织的伤害更小。
常温处理7d的愈伤组织分化频率较高分，为28.3%。
但是长时间处理（45d）也不会导致愈伤组织完全死亡，可以增加诱变的机率。
该育性恢复实验中，经F1代幼穗组织培养的再生植株在移栽入无菌土之前用0.2%秋水仙素溶液浸根24h，其育性恢复率为6.9%。
用秋水仙素溶液浸泡再生苗使大量植株夭亡。
但是，在部分单个株丛的较晚抽出的穗子上发现了自交结实的种子。
每穗的种子数极少（1～7个），而且多数种子瘦小、干瘪、成熟度差。
2.2用除草剂处理培养材料以多年生牧草茎尖作为外植体[24]，用除草剂进行离体诱导加倍，产生的嵌合体少而多倍体较多，可以有效代替秋水仙素。
究其原因可能是由于茎尖诱导形成的愈伤组织不受基因型约束。
张颖[30]以羊草×灰色赖草杂种F1为材料，将在2.0mg/L2,4-D+MS诱导出的胚性较强的愈伤组织放入氟乐灵中振荡处理，然后分化成苗。
其中只有200µM的氟乐灵处理过的愈伤组织绿芽率为80%，出苗率为5%，其他处理均未分化出苗，而且分化出的小苗在移栽过程中也较难成活。