【相差显微镜】
【微分干涉显微镜/DIC】
处理透过光，把肉眼不可见 的光程差，变成肉眼可见的 振幅差（明暗），从而看到 活细胞内一些结构。 处理入射光，通过特殊棱镜，使图 像呈现三维立体效果。
细胞生物学研究方法与技术
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信息转换显微镜
荧光显微镜：基于荧光染料特异性标记的显微镜
分辨率高；多信息同时标记；定位定性定量
单核
பைடு நூலகம்
双参数散点图
淋巴 横纵坐标均表示参 数的强度，细胞数量 由不同方式表达（密 度，等高线等）
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流式的重要概念
设门（gating）
依据散射光信号——确定流式分析的对象范围
1、单细胞系——排除细胞碎片和细胞团； 2、多细胞混合物——从混合物中指定需要分析的细胞成分，门圈的不 同，分析结果也不同。
正常
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多发性骨髓瘤
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4.细胞凋亡分析
AnnexinV/PI 检测 基本原理： PI：DNA染料，不能透过完整的细胞 膜，只能进入已破损的细胞膜。 AnnexinV：与磷脂酰丝氨酸（PS） 结合，正常细胞PS位于细胞膜内 侧，发生凋亡的细胞发生PS外 翻。 结果：
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三、图像流式系统
5. 细胞增殖分析
CFSE染色
原理：羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是 一种对细胞无毒的细胞活性染色剂，通过酯酶裂解 和细胞质扩散过程进入细胞。当细胞分裂时， CFSE平均分配到子代细胞，并伴随检测CFSE信号 值的降低，细胞分裂代数越多，信号降低程度也越 大。
1、定义：指物镜框口能纳进的光通量的大小。数值孔径越 大则进入物镜的光越亮，物镜成像越清晰，镜头越好。 2、计算公式： NA = ·sin/2 NA与介质的折射率和物镜的框口夹角有关。
介 质 折 射 率
材质 真空 空气 水 玻璃 香柏油
折射率 1.0000 1.0003 1.333 1.5~1.9 1.518
缺点 T细胞亚群研究 没有抗体级联 放大效应 非特异性吸附 增强 只能获得一个 指标的结果 能获得多个指 标的相互关系 B细胞亚群研究 树突细胞研究 干细胞表面标志研究 调节性T细胞研究
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2. 胞内分子分析 用试剂破膜（细胞膜/核膜）打孔，让抗体进入细胞。
淋巴细胞
红细胞
大肠杆菌
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透射电镜的主要制样技术
负染技术：用重金属盐对铺展在载网上的样品
染色，吸去多余染料，干燥后，使样品凹陷处铺 上一层重金属盐，从而出现负染效果，分辨率可 达1.5nm左右 。 主要用于观察病毒、大分子蛋白形态结构
第一节重点
1.光镜： ① 物镜的重要参数及意义 ② 不同种类光镜及应用 2.电镜： ①最常用的两种类型 ②观察主要内容
实际放大倍数：目镜的放大倍数乘以物镜的放大倍数
信息转换显微镜
荧光显微镜（FL） 激光共聚焦显微镜
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几何光学显微镜
【明视野观察】
最常见的透射光显微镜模式。 又可分为正置显微镜和倒置显 微镜。
物理光学显微镜
【暗视野观察】
入射光斜射，通过被检 物体的反射光或衍射光 进行观察。消除了强光 直射时因强光绕射造成 的人眼观察不到效果。
光学显微镜的种类与应用
从工作原理分
几何光学显微镜
从视觉效果分
明场（BF） 暗场（DF) 相差（PH）

= 0.61 ————————— NA（数值孔径）
分辨率也与数值孔径相关
物理光学显微镜
微分干涉（DIC） 浮雕相衬（RC）
放大倍数
分为低倍 (4×)、中倍(10×或20×)、高倍 (40×)和油浸物镜(100×)
5、观察细胞膜分子的运动——FLIP/FRAP
光漂白/光漂白后修复： 体现细胞膜蛋白质分子 运动过程，可通过荧光 物质的消失和再生对靶 分子进行观察。
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二、流式细胞仪
什么是流式细胞技术？
1、样品：细胞(常用)或其他微粒； 2、方式：样品在液流环境中逐个被光源照射； 3、结果：收集照射后样品的相关信号。
主要原理
流路系统、光路系统、电路系统、分析系统
激发和分别 收集不同的 光信号
Accuri C6
流式细胞技术能用来干什么？
1、对待测样品实现多参数检测分析(相对大小，相对颗粒 度，相对荧光强度)——大样本量； 2、对混合样品中感兴趣的成分实现分离(分选型)。
液流聚焦
光电信号 的转换和 放大
BD FACSAria Coulter Epics XL
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一、激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal Microscope
第二节：鉴定细胞的设备——基于特 异性荧光染色 1、激光扫描共聚焦显微镜 2、流式细胞仪 3、图像流式系统
激光 扫描
光源（单色光、点光源） 激光在样品上的工作方式
Pinhole
123 标本
因为标本有 厚度，1、 2、3表示不 同的平面
1 2 3
1 物镜 2 3 景深内各点均成像 “2”点位最清晰
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激光扫描层面
2 物镜
仅焦平面上 的点成像
普通荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜
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逐点扫描，光学切片
沿X轴逐点扫描成行 沿Y轴重复行扫
蛋白质磷酸化（常用western blot检测） 转录因子表达（调节性T细胞foxp3染色） 细胞因子分泌（ELISA、ELISPOT检测）
3.细胞周期分析 原理：特异性标记DNA，检测细胞DNA含量的变化
G0/G1期：单倍、 S期：DNA复制（1-2倍之间）、 G2/M期：2倍
S期比率、组织 学分级、预后
同型对照：与实验抗体所带荧光标记及抗体种属、亚型、剂量都 一致的无关抗体
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流式实验的染色方法
流式细胞技术的应用
1.细胞免疫表型分析
染色 方法 直标 间标 单染 多染
优点 简便，特异 性好 提高弱信号 检测灵敏度 不用考虑荧 光补偿 需要调节荧 光补偿
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细胞生物学研究常用仪器
感兴趣的细胞
光镜、电镜 共焦显微镜、流式
观察、鉴定、分离
第一节：观察细胞形态结构的设备 1、光学显微镜 2、电子显微镜
流式、磁珠分选、离心 ELISPOT、液相芯片、 活细胞工作站
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功能
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一、光学显微镜知识
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2、目标分子的定量分析——根据荧光强度
3、图像三维重组
细胞内钙离子定量
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4、目标分子间相互关系研究——FRET
荧光共振能量转移：当两种荧光染料距离 非常近时(2-7nm)，第一种荧光物质的发射 光，成为第二种荧光物质的激发光，使第 二种荧光被激发的现象。
共聚焦 荧光成像原理，光学切片 显微镜 成像分辨率更高，更清晰
人眼分辨率：0.2 mm 光学显微镜分辨率：0.25m 共焦显微镜分辨率：0.18m（属于光学显微镜） 电子显微镜分辨率：0.2 nm 细胞生物学研究方法与技术
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共聚焦原理——针孔成像
成像焦平面 焦平面上有探测针孔
主要是通过特异性抗体标记实现。 荧光信号的变化是流式实验的主要的结果。
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外周血细胞
侧 向 散 射 ： 结 构 前向散射：大小
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流式分析的图形
中性粒
单参数直方图
横坐标：参数的强度 纵坐标：各个不同强度 处细胞样品数量统计 值（细胞计数）
AV-/PI-活细胞 AV+/PI-早期凋亡细胞 AV+/PI+晚期凋亡细胞
DNA断裂点标记——BrdU法
细胞凋亡时核酸内切酶将DNA从 核小体处切断，产生3’-OH末端， 能与标记的dUTP结合。
PI单染——非整倍体凋亡峰
凋亡峰：细胞凋亡，DNA降解， 不完整，在G1期峰之前形成非整 倍体凋亡峰。
光学显微镜最重要的原件——物镜 性能 参数
1、数值孔径（NA, numeric apeture） 2、分辨率（） 3、放大倍数,工作距离,视场直径,等等 1、相差等特殊记载 2、矫正相差和色差的能力 3、放大倍数、数值孔径、介质 4、镜筒、盖玻片厚度 5、放大倍数颜色标志
物镜的数值孔径
数值孔径 numeric apeture （NA）
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扫描电镜
观察样本表面 完整细胞 细胞断面
冷冻蚀刻
将冷冻断裂的样品的 温度升高，让样品中 的冰在真空中升华， 而在表面上浮雕出细 胞膜的超微结构。而 后对浮雕表面进行铂 碳复型。
透射电镜
电镜受电子束穿透能力的限 制，必须把标本切成厚度小于 0.1um的薄片才适用，这种薄 片称为超薄切片。 电镜的实际分辨率与切片的 厚度相关，实际分辨率 = 切片 厚度的1/10 细胞直径：20um 超薄切片：40~50nm 分辨率：4~5nm（观察亚细胞结构）
流式实验的对照