(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910384933.8
(22)申请日 2019.05.09
(71)申请人 宁夏回族自治区食品检测研究院
地址 750004 宁夏回族自治区银川市金凤
区凤台路180号金宇名庭南区1号楼
(72)发明人 岳苑　李睿　周梦诗　徐娟　吴明　
赵飞　何微　贾冰凝　汪洪　
高俊峰　
(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限
公司 11002
代理人 王文君　陈征
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/385(2006.01)C12R 1/40(2006.01) (54)发明名称
鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法
(57)摘要
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及
鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。

本发
明通过对铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的基因
组序列进行分析，提供了用于高分辨熔解曲线技
术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性
引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。

在此基础
上，建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假
单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。

该方法具有较高
的灵敏度、特异性和准确性，能够高效检出铜绿
假单胞菌和恶臭假单胞菌，具有操作简单、成本
低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业
生产、
食品安全等领域的假单胞菌的鉴别。

权利要求书1页 说明书9页序列表3页 附图7页CN 110106266 A 2019.08.09
C N 110106266
A
权　利　要　求　书1/1页CN 110106266 A
1.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。

2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒中的应用。

3.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。

4.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌中的应用。

5.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在饮用水、食品、农产品的假单胞菌检测中的应用，或在农业生产安全或食品安全监测中的应用。

6.一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行荧光PCR扩增；
(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15s，68℃退火40s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；
熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤
①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。

9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ 0.3μL、20×Evagreen in Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。

10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰且峰形与恶臭假单胞菌的标准菌株一致，则判断待测样品恶臭假单胞菌检出；若Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰且峰形与铜绿假单胞的标准菌株一致，则判断待测样品铜绿假单胞菌检出。

2。