假单胞菌属Pseudomonas
种类：
• • • • • • • 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) 荧光假单胞菌(P.fluorescence ) 恶臭假单胞菌(P.putica ) 斯氏假单胞菌(P.stutizeri) 曼多辛假单胞菌(P.mendocina) 产碱假单胞菌(P.alcaligenes) 假产碱假单胞菌 (P.pseudoalcaligenes)
绿或灰绿 有溶血环 • MACc平：微小无光泽半透明 48h后菌落 呈棕色
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
• 细菌耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗生素泵出胞外 –抗菌药物作用靶位改变 –膜孔蛋白突变 –生物膜屏障作用
典型型（普通平板上）
菌落中央凸起 边缘扁平 表面粗糙
粗糙型（麦康凯平板）
菌落圆形凸起 似大肠埃希菌菌落
大肠型（麦康凯平板）
常见非发酵菌初步分群鉴定
试验 假单胞 不动杆 产碱杆 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属 氧化酶 + + + + 葡萄糖O/F O/O/O/F 动力 + + MAC平板生长 + + + +/-
铜绿假单胞菌
致病性
• 广泛存在环境中的条件致病菌，是院内感染 主要病原菌 • 可引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、 烧伤感染、囊性纤维变性等 • 有多种毒力因子：包括菌毛、荚膜多糖、内 毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶、磷脂酶 等
• 粘附素：菌毛的神经氨酸酶分解上皮细胞表面的 神经氨酸促进细菌侵入 • 荚膜：多糖类物质抗吞噬细胞的吞噬作用；使细 菌锚泊在细胞表面，与呼吸道感染有关 • 内毒素、外毒素 • 绿脓菌素：绿色色素，由铜绿假单胞菌的RpoS基 因编码产生的代谢产物，具有氧化还原活性的化 合物，能催化超氧化物和过氧化氢产生有毒氧基 团，引起组织损伤。在致病中起重要作用 • 弹性蛋白酶：降解弹性蛋白，引起肺实质损伤和 出血；降解补体和白细胞蛋白酶抑制物；可与相 应抗体形成复合物，沉积于感染组织中 • 磷脂酶C
菌名 铜绿假单胞菌 荧光假单胞菌 恶臭假单胞菌 斯氏假单胞菌 洋葱伯克霍尔德菌 腐败希瓦讷拉菌 色素 绿脓素、红脓素、青脓素、荧光素 荧光素 荧光素 未定名黄色素 未定名黄色素、紫色素 未定名色素 颜色 蓝、红、黑、黄色 黄绿色 黄绿色 黄色 黄色、紫色 淡红褐色
各种标本
血平板和Mac平板 可疑菌落 涂片革兰染色 革兰阴性杆菌
• 溴化十六烷基三甲铵——具 有优良的渗透、柔化、乳化、 抗静电、生物降解性及杀菌 等性能。本产品化学稳定性 好， 耐热、耐光、耐压、 耐强酸强碱。
培养基成分： 营养琼脂培养基
• • • • • 胨 10g 牛肉浸出粉 3g 氯化钠 5g 琼脂15~20g 水 1000ml
书本P159 5.2
• （以营养肉汤培养基的处方及 制法）取上述成分，混合，煮 沸溶解后，调节pH值使灭菌后 为7.2±0.2，分装，灭菌。
十六烷基三甲基溴化铵平板
36±1℃ 24h
营养琼脂斜面
36±1℃ 24h
革兰氏染色镜检
阴性 报告
氧化酶试验
氧化酶试验 阴性
阳性
绿脓菌素试验 阴性 阳性
42℃生长试验
特性
• • • • 非发酵革兰氏阴性杆菌 常见的条件致病菌 菌体的一端有单鞭毛 在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运 动活泼。
• • • • • • •
绿脓菌素
• 绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基 (PDP琼脂)
胨 20g 甘油 10ml 氯化镁(无水) 1.4g 琼脂 18~20g 硫酸钾 10g 水 1000ml 取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温 使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1， 加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分 装于试管，灭菌，置成斜面。
假单胞菌属
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 革兰氏阴性 细胞单个 直的或弯的杆菌 0.5—1 × 1.5—4微米 单鞭毛或多鞭毛 有机化能异养菌 呼吸代谢，永不发酵 严格好氧菌
模式种：铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌
• 1.0.5-0.8*1.5-3.0微米的杆菌 • 2.细胞单个 • 3.成对或成短链。以极生的单鞭毛运动（有 二个或二个以上的极生鞭毛的细胞，但不 常见） • 4.在中性或碱性培养基种呈蓝色：在酸性培 养基种呈红色 • 5.专性好氧，在硝酸盐培养基中除外。
培养基成分：
PDP斜面，是否有色素，有， 用氯仿3-5ml萃取，用无菌 玻璃棒搅碎培养基、混匀， 色素完全在氯仿层。吸管 把氯仿层移到另一试管， 加入盐酸1M1ml，静置后， 盐酸出现粉红为阳性，无 粉红为阴性，阴性斜面培 养1-2天再重新做一遍。如 果仍是阴性。做下一步试 验。 绿脓菌素从有机相转到酸性 水相中会由蓝绿色变为粉 红色。
氧化酶(+)、OF：O 非发酵菌鉴定系统鉴定到种
微生物检验程序
• 生化反应： 氧化酶+ OF：O 硝还+ N 2+ 液化明胶+ 枸橼酸盐+ 精双 水解+ 乙酰胺酶+ 吲哚-
铜绿假单胞菌
电镜图
铜绿假单胞菌
• 抗原： O抗原(外膜蛋白-保护性抗原 脂多糖-型特异性) H抗原 血清学分型 • 抵抗力： 抵抗力强 耐干燥 不耐热 多重耐药 在室温水中长期生存 4℃不生长
• 本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃， 最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在 4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以 鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水 溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧 光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。在血 平板上会有透明溶血环。 • 该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原 （鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种 是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂 多糖，有特异性。O抗原可用以分型。
嗜麦芽 15%
其他 13%
不动杆菌 16%
铜绿假单胞 菌 56%
非发酵菌分离率
假单胞菌属Pseudomonas
• 共同特点： G-b 菌体细长 单端鞭毛 无芽胞 专性需O2 营养要求不高 35℃生长，少数4℃、42 ℃生长 葡萄糖O/－ 动力+ 氧化酶+ 可产多种色素：绿脓素 荧光素 脓玉红素
各种菌产生的色素
牛胆盐为抑菌剂，用于抑制一些杂菌的生长 。
出处：《中国人民共和国药典》2010版二部 附录 XI J 微生物限 度检查法 P114
培养基成分：
• • • • • • • •
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 胨 10g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g 牛肉浸出粉 3g 琼脂 15~20g • 溴化十六烷基三甲铵琼脂培 养基是铜绿假单胞菌的选择 氯化钠 5g 性培养基，也是美国药典和 水 1000ml 中国药典等国推荐使用于食 除琼脂外，取上述成分，混合， 品、药品中铜绿假单胞菌检 微温使溶解，调节pH值使灭菌后 测的培养基。 为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化 后，分装，灭菌，冷至60℃，倾 注平皿。 书本P161 5.14
铜绿的菌落分型



典型型 大肠菌样型 粘液型 侏儒型 粗糙型
菌落光滑凸起 成粘液状
粘液型（麦康凯平板）
粘液型（血平板）
细小，无光泽 半透明菌落
侏儒型（麦康凯平板）
菌落呈灰绿色 大小不一 扁平湿润 边缘不规则 呈伞状伸展 表面常可见 金属光泽
典型型（麦康凯平板）
产绿脓素 琼脂染成黄绿色
• 各种抗生素治疗铜绿假单胞菌所致感染过程中都可 能发生耐药。初代敏感菌株在治疗3－4天后可能发 生耐药，有必要重复分离菌株 • 本菌对多种抗生素天然耐药，常用三代头孢和氨基 糖苷类联合治疗
鉴定结果分析
• 从临床标本中分离出来的铜绿假单 胞菌，需要排除污染因素 • 铜绿假单胞菌下呼吸道感染需连续 三次痰培养阳性才能确立。
菌落特征
感染途径：
当机体免疫功能受损或缺损时，可引起严重的甚至致死性的感染。
1.正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道 内，呼吸道和肠道均有该菌存在，但分离率较低。 2. 医源性感染
3.术后操作感染（气管切开、保留导尿管等）
4.人、病人与病人的接触也为传播途径之一
检查意义：
• 人及动物的皮肤、肠道、上呼吸道等处都有该菌存在。绿脓杆菌抵 抗力较强，湿热55℃1小时才被杀死。 • 对紫外线不敏感。对多种抗生素易产生耐药性。本菌仅于人体防御 功能改变或直接进入机体（如通过泌尿道插管及静脉导管、呼吸道 的通气设备和其他治疗检查方法）以及混合感染时才具有致病性。 • 长期使用抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或大面积烧伤、肾 功能不全、心脏病、慢性支气管肺疾患的患者易继发绿脓杆菌的感 染。
• 绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。
培养基成分：
• • • • •
胆盐乳糖培养基（BL）
胨 20. 0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5. 0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (或去氧胆酸钠） （0.5g) 磷酸氢二钾 4. 0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶 解，调节P H值使灭菌后为7 . 4 ± 0 . 2，煮沸，滤清，加入 乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
• 书本P163 5.26
样 品 10g
10 ml
BL
100 ml
缓冲液
供试 液
10ml
BL 阳性
BL 阴 性 十六烷基三甲基溴化铵平板
培养温度： 36℃
营养琼脂斜面
培养时间： 十六烷基三甲基溴化铵平板 18~24h （必要时可 延长至48h）