第7章、细菌感染的检测方法与防治原则
2016-3-23
本章重点与难点
• 细菌感染性标本的采集原则 • 细菌感染的实验室检验程序 • 常用的血清学诊断方法 • 适应性免疫的获得方式 • 人工免疫的概念和常用的免疫制剂 • 细菌感染的治疗原则
2
第一节 细菌感染的实验诊断
3
细菌感染的实验室检验方法
形态学检查 含菌 标本
15
稀释法
• 以一定浓度的抗菌药物与含有待检细菌的培 养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍 稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。 • 稀释法
– 琼脂稀释法——使用琼脂培养基 – 肉汤稀释法——使用肉汤培养基
16
抗生素连续梯度法（E-test法）
将稀释法和扩散法的原理相结合，使用预先设 定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度，采用琼脂培 养基培养以确定不同抗菌药物对微生物的最低抑菌
掌握
细菌培养、形态学检查 生物试验、血清学鉴定
细菌分离培 养与鉴定 抗原 检测
动物试验、药物敏感试验
凝集试验、免疫荧光技术 酶免疫技术、免疫印迹试验 等 核酸杂交、PCR
可疑细菌 感染
细菌成 分检测 核酸 检测
16S rRNA基因序列分析 基因芯片等
直接凝集试验
血清（双 份）标本
特异性抗 体检测
乳胶凝集试验 补体结合试验 ELISA等
等减毒活疫苗。
30
活疫苗与死疫苗的比较
区别点
制品特点 制备方法 接种次数和接种量 接种反应 免疫的类型 免疫效果 毒力回升与安全性 疫苗的稳定性 保存
活疫苗
减毒或无毒的疫苗 通过非正常培养减毒株 1次，量小 可在体内增殖，类似轻型 感染或隐性感染 体液免疫和细胞免疫 1～5年 有可能，对免疫缺陷者有 危险 相对不稳定 不易保存，4℃存活2周， 真空冻干可长期保存
16S rRNA 基因序列 分析
基因芯片 技术
21
（五）生物芯片技术
将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及 组织等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支 持物上，在一定的条件下进行生化反应。 用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果， 通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据
分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。
26
一、人工主动免疫
人工主动免疫（artificial active immunization）是 将疫苗或类毒素接种于人体，刺激机体免疫系统产生特 异性免疫应答，机体主动产生获得性免疫力的一种防治 微生物感染的措施，主要用于特异性预防。 采用人工主动免疫方法通常称为预防接种 （prophylactic inoculation）或疫苗接种（vaccination）。
将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌 而制成的疫苗。转入的目的基因可整合到细菌或病毒的
基因组上或以质粒的形式存在。
35
核酸疫苗
核酸疫苗（nucleic acid vaccine）也称DNA疫苗。 是将编码保护性抗原的基因重组到质粒真核表达载体
上，然后将重组的质粒DNA直接注射到宿主体内，外
沉淀试验
间接免疫荧光技术 补体结合试验 中和试验 酶联免疫吸附试验
梅毒
各类微生物感染 Q热 风湿热（抗O试验） 各类微生物感染
24
第二节 细菌感染的特异性预防
25
掌握
机体获得特异性免疫力的方式
自然免疫 主动免疫：隐 性或显性感染
被动免疫：获 得母体的Ab(胎 盘/初乳)
人工免疫
主动免疫：疫 苗或类毒素等 被动免疫：抗 毒素或丙种球蛋 白等
– 能够完全抑制培养基中细菌生长的最低药物浓度
• 最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）
– 能够杀死培养基中细菌的最低药物浓度
14
纸片扩散法
含有定量抗生素的纸片贴在已接种待检病原菌
的琼脂平板上，纸片上的抗生素向周围琼脂中扩散， 形成了逐渐减小的药物浓度梯度。 检测抑制病原菌生长的大小不同的抑菌环。 根据抑菌环的有无和大小来判定试验菌对该抗 菌药物耐药或敏感。
特异性预防
疫苗
类毒素
27
27
疫苗的种类
– – – – – – 死疫苗：伤寒疫苗、霍乱疫苗 活疫苗（减毒活疫苗）：卡介苗（BCG） 亚单位疫苗：肺炎链球菌荚膜多糖 基因工程疫苗 载体疫苗 核酸疫苗
28
死疫苗
• 死疫苗（killed vaccine）：用物理、化学方法杀死
病原微生物，但仍保持其免疫原性的生物制剂。
37
二、人工被动免疫
人工被动免疫（artificial passive immunization）是输入含有特异性抗体的免疫血 清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂， 使机体立即获得特异性免疫力的过程，可用于某 些急性传染病的紧急预防和治疗。
38
抗毒素(antitoxin)
• 将类毒素或外毒素给马进行多次免疫后，待马匹产生 高效价抗体后采血，分离血清，提取其免疫球蛋白精 制成抗毒素制剂。 • 主要用于外毒素所致疾病的治疗和紧急预防。临床常 用的有破伤风、白喉精制抗毒素、肉毒抗毒素以及气 性坏疽多价抗毒素等。 • 使用这种异种抗毒素时应注意避免Ⅰ型超敏反应的发 生。
• 举例
– 肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌表面 的荚膜多糖，钩端螺旋体的外膜蛋白等。
33
基因工程疫苗
利用基因工程技术把编码病原体保护性抗原表位
的目的基因，导入原核或真核表达系统后，用表达的 保护性抗原所制成疫苗称为基因工程疫苗（gene engineered vaccine）。
34
重组载体疫苗
源基因在体内所表达的抗原能刺激机体产生免疫应答。
36
类毒素
• 外毒素经0.3%～0.4%甲醛处理后，失去了毒性但仍 保持免疫原性的生物制品。加入吸附剂（佐剂）氢氧 化铝后便制成精制类毒素（toxoid）。 • 吸附剂可延缓类毒素在体内的吸收时间，刺激机体产 生足量的抗毒素。 • 举例：白喉类毒素、破伤风类毒素
一.临床标本的采集与运送原则
标本采集
标本运送
早期采集
无菌操作
选感染部位 最佳时间采集
做好标记 置于密闭容器内 尽快送检
双份血清
二、细菌的检测
6
（一）细菌的形态学检查
暗视野 显微镜 相差 显微镜
不染色 标本
主要用于检查在生活状态下 细菌的动力及其运动情况
7
革兰 染色 抗酸 染色
荧光金胺
O染色
其他 特殊染色
浓度（MIC）。
17
自动微生物鉴定及药敏分析系统
将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液，放入自动微
生物鉴定及药敏分析系统中，通过计算机自动扫描、读数、
分析、最后报告鉴定及药敏结果。
摘自 《临床微生物检验》（第五版）人民卫生出版社
18
自动微生物鉴定及药敏分析系统
微生物数码鉴定原理 计算并比较数据库内每 个细菌条目对系统中每 个生化反应出现的频率 总和 药敏检测原理 微型化的肉汤稀释试验 根据CLSI标准得到相 应敏感度：敏感、中度 敏感和耐药 系统组成 测试卡（板）、菌液 接种器、培养和监测 系统、数据管理系统
死疫苗
死菌，仍保持免疫原性 通过物理化学方法使病原体失 活 2～3次，量大 在体内不增殖，可出现发热、 全身或局部肿痛等反应 体液免疫 0.5～1年 不可能，安全性好 相对稳定 易保存，4℃可保存1年以上
ห้องสมุดไป่ตู้31
新型疫苗
亚单位疫苗
基因工程疫苗 重组载体疫苗 核酸疫苗
32
亚单位疫苗
• 利用微生物的保护性抗原制成的不含有核酸、能诱 发机体产生免疫应答的疫苗，称为亚单位疫苗 （subunit vaccine）。
• 常用的有：伤寒、霍乱、流行性脑膜炎、钩端螺旋
体病等灭活疫苗。
29
活疫苗（减毒活疫苗）
• 减毒活疫苗（attenuated vaccine）是通过毒力变异或 人工选择法（如温度敏感株）而获得的减毒或无毒株， 或从自然界直接选择出来的弱毒或无毒株经培养后制 成的疫苗。
• 常用的有：BCG、鼠疫、炭疽、脊髓灰质炎、麻疹
自动微生物鉴 定及药敏分析 系统
性能特点
自动化程度较高、检测速度 快、可鉴定细菌种类及药敏 试验种类多、数据处理软件 功能强大、结果准确可靠
19
（三）细菌抗原的检测
凝集试验
用已知抗体检测待检标本中未知的颗粒性抗原。
协同凝集试验
IgG的Fc段与金葡菌的SPA结合，Fab段与细菌抗原 结合后，可使金葡菌发生肉眼可见的凝集现象。 用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原，借 助荧光显微镜观察。
细菌的染色
8
革兰染色
葡萄球菌（革兰染色阳性）
大肠埃希菌（革兰染色阴性）
9
9
(二) 细菌分离培养与鉴定
细菌检查的一般程序
脓 /痰 / 尿 涂片、染色、镜检 生化反应 血清学鉴定 药敏试验 动物实验
标本 血、脑 脊液等
分离培养
纯培养
增菌
10
细菌的分离培养
• • • • • 培养基的成分 pH 培养时间 温度 气体环境
43
抗菌药物治疗性应用的基本原则
• 诊断为细菌性感染者，方有指征应用抗菌药物； • 尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物敏感 试验结果选用抗菌药物；
• 按照药物的抗菌作用特点及其体内过程特点选择用
药； • 抗菌药物治疗方案应综合患者病情、病原菌种类及 抗菌药物特点制订。
44
复习思考题
1. 取脑脊液进行细菌感染的检查，用什么免疫学方法可以进 行快速诊断？
2. 检查病原菌抗原和血清中的特异性抗体选用的免疫学方法