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（四）细胞破碎
2．物理破碎方法 ①反复冻融法 ②超声波破碎法 ---- 超声波多用于微生物细胞 的破碎。 3．化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞 膜的透过性改变。 有机溶剂：丙酮，甲苯，丁醇，氯仿等。 表面活性剂：SDS、特里顿（Triton）、氯 化十二烷基吡啶、吐温（Tween）等。
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（四）细胞破碎
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分配层析 萃取 结晶
（一）．浓缩 从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的 ）．浓缩---从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的 浓缩 溶液的过程。 溶液的过程。
浓缩的方法： ①沉淀法 ②蒸发浓缩 ③吸收浓缩 ④超滤法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ21
（二）．干燥 把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶 ）．干燥---把潮湿的固体 膏状物、 干燥 把潮湿的固体、 剂除尽的过程。 剂除尽的过程。
→
实验步骤
待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液） 垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制 加样（酶溶液） 电泳（浓缩胶80V 分离胶150V） 剥胶 染色和褪色（0.25%考马斯亮蓝R250 漂洗 脱 色） 得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高
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离子交换柱层析法实验原理
混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地 进行 交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各 组分 间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上 述相 同重复过程时，各自的情况就有会所不同，从而 使各 物质得以分离。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧 甲基纤维素； CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨 基乙基纤维素； DEAE—纤维素），当被分离的蛋白 质溶液流经离子 交换层析柱时，带有与离子交换剂相 反电荷的蛋白质 被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度 办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
设计实验报告展示 生物大分子分离纯化及肝酶提 取
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一、生物大分子的分离与纯化技术
二、肝酶提取
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首先要确认要分离的生物大分子是什么？ 首先要确认要分离的生物大分子是什么？
核酸？ 蛋白质？ 多糖？ 脂类 ？ 其次根据不同生物大分子的特性制定不同的实验条件
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生物大分子分离纯化的特殊性
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就 极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生 物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温 度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的 综合影响，很难准确估计和判断。
4．酶学破碎方法 ①外加酶制剂 ②自溶法 通过细胞本身存在的酶的作用使细胞 壁自行破裂。
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（五）．细胞器的分离 ）．细胞器的分离
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1．离心技术 ．
常速离心机； 高速离心机； 超速离心机；
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2．分离细胞器的方法 ．
差速离心法 密度梯度离心 等密度离心
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（六）生物大分子的提取
影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。 通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生 物活性。
材料选择：选取新鲜的，饥饿24小时的动物的 肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。
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2.制作组织浆液 制作组织浆液
取新鲜动物肝脏剪碎冰放进培养皿中 移入匀浆器 过滤
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梯度离心获得含有酶的细胞液
1：离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻 轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清 液（1） 2：沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，3500r/min离 心10min， 得上清液（2） 3： 将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min 离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体
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（一）．粗制品的分离方法 ）．粗制品的分离方法
蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀法，有 机溶剂分级分离法等。 RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、苯酚 法等。 特点：简便，处理量大，既能除去杂质又能 浓缩样品。 缺点：分辨率低。
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（二）．精制品的分离纯化方法 ）．精制品的分离纯化方法
离心、柱层析法、电泳法等。 特点：规模小，分辨率高。
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6.鉴定肝酶纯度
实验原理：Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 实验原理 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED） SDS( SDS(十二烷基磺酸钠:阴离子表面活性剂）能打断蛋白质的氢键和疏水 : 键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷 的 量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差 异。 SDS-PAGE常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被 鉴定的蛋白质很 纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含 有相同分子量亚基的具有四级结 构的蛋白质，那么SDSPAGE后就只出现一条蛋白质区带。 不连续凝胶 电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上 层为浓缩胶，下层为分离胶， 两层中Acr（丙烯酰胺） 浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子 在浓缩 胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小 孔径分离 胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样 品浓缩成很窄的区带。 分 离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋 白质来说，通过时受 到的阻滞不同，即使静电荷相等的 颗粒也会由于此分子筛的作用，将不 40 同大小的蛋白质分 开。
真空干燥 冷冻真空干燥
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（三）．样品的保存 ）．样品的保存
1．干粉保存：0~4℃ 冰箱中保存即可（样品置 于干燥器中）。 2．液态保存：0~4℃ 冰箱即可。不能放在0℃ 以下，因为结冰会使大分子构象破坏，使其失 活。
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（一）．含量的测定 ）．含量的测定
测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。 测定蛋白质和酶总量——凯氏定氮法，Folin-酚法， 双缩脲法，紫外吸收法等。 测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。
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粗蛋白
纯 化 蛋 白
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实验步骤
DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl） 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或 20% 磺基水 杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号 为横坐标，收 集第二个峰的蛋白溶液 处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量 为纵坐 标，收集管号为横坐标，收集第一个峰的酶溶 液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液
差速离心、超率、分子筛、透析 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等 电泳、等电点聚焦、离子交换层析、吸附层 析 亲核层析、疏水层析、共价层析
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此外，还可根据以下性质选 择合适的分离纯化方法：
电荷性质的差异 离子交换层析法 凝胶过滤法 分子大小形状差异 超滤法 离心法 溶解度差异 透析法 沉 淀 法 盐析 有机溶剂沉淀 选择性沉淀 电泳法
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3.肝酶的粗提 肝酶的粗提
原 理 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷和 水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析 出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度 不同。例如，50％饱和的硫酸铵能使血清中 的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ球蛋白沉淀。）因此，可根据所要分离的蛋 白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐 析。
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⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶 蛋白质和酶的提取一般以水溶 液为主。 液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性 溶解度大， 好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶 剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或 一些和脂类结合比较牢固或 分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、 分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、 稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机 稀盐、稀酸、或稀碱中， 溶剂提取。 溶剂提取。
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肝酶分离纯化与鉴定
设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、 和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结 合酶，pI=6.2）的技术路线，并说明试验各步 骤的原理
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实验流程： 实验流程：
1.取动物肝组织 2.制作组织浆液 3.肝酶的粗提取 4.肝酶纯化 5.活性检验 6.鉴定肝酶纯度
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1.取动物肝组织 取动物肝组织
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一、生物大分子制备的前期准备
二、分离纯化
三、生物大分子的浓缩，干燥和保存 四、生物大分子含量的测定和纯化鉴定
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前期准备
（一）、明确目的和要求 （二）、了解的生物大分子的物学性质
1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、 在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中 的分配系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各 种化学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。
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（二）．纯度鉴定 ）．纯度鉴定
蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用2~3种不同的鉴定 方法才能确定。 核酸的纯度鉴定从测A260/A280 光吸收比值可判定样品 的纯度。 RNA，A260/A280≈2以上， DNA，A260/A280≈1.8左右,若DNA的A260/A280＞1.8， 说明制剂中存在RNA,需要考虑用RNA酶处理样品，提高 DNA纯度。
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5.活性检验 活性检验
实验原理 结合酶的辅助因子按其与酶蛋白结合的 紧密程度 不同分为辅基和辅酶，辅基与酶蛋白共 价键紧密结合， 透析超滤等物理方法不能除掉， 辅酶与酶蛋白非共价 结合，较为疏松，透析和超 滤等方法可以分离。