2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；
3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性Fra bibliotek、定 位准确；
4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度 与放射性探针相当；

5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色 可同时检测多种序列； 6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的 变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结 构。

1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。


均匀标记有切口平移法、随机引物法和 PCR扩增等方法。


• 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一 般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 • 该方法使用时应注意： • A. 只能标记双链 DNA 使用探针时要预先变性后再 使用，而且标记时DNA片段不太小 • B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎， 不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口， 使标记物不能进入缺口 • C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不 足，影响杂交的进行
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上 加盖玻片
在荧光显微镜下观察
变性 检测 杂交

探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。

几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术
2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术
4 原位PCR

荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。

1、不但可用于双连DNA的标记，而且 可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高


末端标记
直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素 原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复 合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进 行，所以称之为末端标记。

荧光原位杂交的发展前景
FISH技术在遗传学研究中已经取得了不小的成绩， 但是其深度与广度还不够，尤其与生产实践、经 济效益的联系不够紧密。 随着标记手段、检测试剂、荧光观察等技术的发 展,FISH 技术的应用范围在不断扩展, 今后该技术 在研究细胞核骨架与基因表达的关系,基因转录、 重排、扩增,基因组结构与调控,哺乳动物的染色体 进化研究及亲缘关系等领域将会起到积极的作用。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
杂交步骤和过程 分别由20多步、15h缩减为不到 10步、2h



荧光原位杂交的应用
一、基因定位 二、物理图谱的构建 三、染色体结构分析与数目测定 四、物种起源、进化和亲缘关系研究 五、转基因的细胞学鉴定 六、基因表达分析和临床病毒学检测


奥芬兰海水硝化细菌荧光原位杂交
全菌（采用EUB MIX型探针）
氨氧化细菌（采用NSO1225型探针）
全菌（采用EUB MIX型探针）
亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针）

荧光原位杂交特点
优点
1、荧光试剂和探针经济、安全；
（Fluorescence in situ hybridization,FISH）
主讲：张奎 学院：生物技术学院 学号：222007331212003
原位杂交（ISH）
原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记 的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。


发展历史
1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。

1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。

探针标记
为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。

均匀标记
对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。

1
放射性同位素
3H、35S、125I、32P等
2 2
非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等

同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理

经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更 多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记 引物。


染色体显带
显带染色是将染色体经 过一定程序的处理,并用 特定的染料染色后,使染 色体在其长轴上显示出 一个个明暗交替或深浅 不同的横纹,这样的横纹 就叫做染色体的带。

缺点 1、不能达到100%杂交，特别是在应 用较短的cDNA探针时效率明显下降。 2、必须在已知探针的情况下方可进行。

FISH技术新进展
随着FISH的广泛应用，FISH本身也得到长足进步。 这主要表现在以下几个方面： 探针 由最初的每次杂交用一种探针发展为每次杂 交用多种探针，即由单色荧光原位杂交发展为多色 荧光原位杂交 标记物质 由单一的几种发展为现在的几十种

基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。

寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析

每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一 定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每 条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色 体显带。 染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效 的方法。
染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体 的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。

20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的 发展和广泛应用。

FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 杂 交
（染色体显带） 荧光显微镜检测 结果分析


肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。

PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则

与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。

1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要 采用放射自显影进行检测,这种检测上的限 制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原 位杂交技术不能很快得到广泛应用。

FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。