0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法

一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。

(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法

二、原理：
一.

实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。

掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。

并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。

三、 仪器

中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
四、试剂

蒸馏水1000ml左右/组，平菇干燥粉末20克/组 0.1mg/mL的葡萄糖溶液15ml/组; 蒽酮试剂10ml/组， 0.5mol/L NaOH10ml/组；5%苯酚体积15ml/组。
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂
1、实验仪器
试管10ml（×7）/ 2人 不同刻度吸管若干支。
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
三、仪器与实验试剂
2、实验试剂：
2.1、双缩脲试剂：取1.5g硫酸铜（CuSO4· 5H2O） 和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H406· 4H2O）溶于
3.1 多糖定性鉴定
3.1.1甲醇法:多糖样品配成lmg/ml水溶液，取 lmL0.5mol/LNaOH，加入甲醇lml，出现白色混浊现 象，则判断为有多糖。(以蒸馏水作为对照)。 3.1.2蒽酮法:多糖样品配成lmg/ml水溶液，取 0.lml，加入lml0.5molNaOH，再加入蒽酮试剂几滴， 呈蓝色的反应，则判断为有多糖。(以蒸馏水为对 照 )。
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。
在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红 色复合物，而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构 类似，也能与铜离子在在碱性环境中形成紫红色复 合物，其最大光吸收在540nm。

在一定浓度范围内，蛋白质浓度与双缩脲反应所呈 颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。
1、平菇多糖的提取 取平菇干粉10克/每组，1000ml的的磨口锥形 瓶中，按料液比15ml/克原料加入蒸馏水，轻 轻摇匀。 将该装有原料液的锥形瓶放置于85℃的水浴 锅中进行恒温萃取90min。萃取过程中，每隔 15min左右轻轻摇晃锥形瓶。萃取完成后，将 其放在离心管中，在4000r/min条件下离心 15min，得到平菇多糖提取液。

五、操作


2、平菇多糖的分离纯化
将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖
液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，
在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，
将烧杯中的溶液放在离心管中，在
4000r/min条件下离心15min，得到平菇多
糖沉淀。
五 操作


3、平菇多糖的鉴定
离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用

五 操作

3.2 定量测定


3.2.1葡萄糖标准曲线的制作及回归方程的确定
精密吸取标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2mL于10mL以上的试管中,补加蒸馏水至2mL; 另精密吸取2mL蒸馏水作空白对照,分别加入5%苯酚 溶液1mL,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0mL,即刻摇 匀,室温静置20min,于分光光度计490nm处测定吸收 度。以吸收度A1为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘 制标准曲线,可得回归方程:葡萄糖浓度在10～ 60μg· mL-1范围内,与吸光度呈良好的线性关系。
用0.9%NaCl溶液配制
2.3 待测样品液：用酪蛋白配制
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 四、实验操作方法
1．标准曲线的绘制
取干净试管6支，按0、1、2、3、4、5、6编号，按 下表加入。各管加入试剂，充分混匀，即有紫红色出
现，用540nm光测定各管A值，绘制C—A曲线。
编号
标准蛋 白ml
水ml 双缩脲 ml
能按3ml体积计算,测定液放置不能擦后果 30分钟，防止
出现沉淀)
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲

实验报告：


1、简写出实验目的、原理
2、作出标准曲线图并得出标准曲线和相关系数。
3、计算未知蛋白液的浓度。
4、写出实验注意事项与讨论 （注意：一定要把原始数据填入原始数据栏）
实验二、植物多糖的提取、分离 与鉴定
500ml蒸馏水中，搅拌加入300ml的10% NaOH液
（可另加1gKI以防止Cu离子自动还原成一价氧化 亚铜沉淀），用水释至1000ml。此试剂可长期保 存。若有黑色沉淀产生需重配。 （已配制好，可直接取用）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
三、仪器与实验试剂 2、实验试剂： 2.2 标准蛋白溶液：10mg/ml的酪蛋白溶液可

五、操作
五、操作


2、平菇多糖的分离纯化
在250ml分液漏斗中加入旋蒸仪中浓缩得到 的25ml左右多糖提取液，然后按提取液： Sevag试剂[氯仿:正丁醇=2:1(v:v)的混合 液]3:1的比例加入Sevag试剂。 混匀后于分液漏斗中振摇10min，用50ml离 心管在3500r/min下离心然后静置到分层清 晰,弃去下层有机相以及中间蛋白质与 Sevag试剂生成的凝聚物, 得上清液。