酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method）一、原理酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。

该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。

将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。

进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。

根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。

二、实验步骤①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因；②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度；③提取总RNA，合成c DNA双链；④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆；⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆；⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。

如可进一步分析DNA确切的结合位点。

三、图片分析1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。

故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。

2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。

取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。

证实15mM[3-AT]的选择是正确的。

挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F'后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。

四、严谨性分析1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。

菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制，而在30mM 3-AT下完全不能生长。

故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。

2、存在假阴性结果。

Pull-downs的原理、步骤、图片分析、实验严谨性原理：用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（GST-、 PolyHis-或生物素-），借助蛋白质之间的亲和性，如酶与底物( 谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶) 或抗原与抗体(Myc蛋白与其抗体) 、细菌受体与血清蛋白、多聚组氨酸与金属离子等的亲和性，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。

用以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

步骤：Step1：从裂解液中固定化融合标记的“诱饵蛋白”Step2：洗脱未结合蛋白Step3：结合“猎物蛋白”到固定化的“诱饵蛋白”Step4：洗脱未结合蛋白Step5：洗脱蛋白质-蛋白质混合物Step6：通过SDS-PAGE或Western分析蛋白与蛋白的相互作用图片分析：图5是利用GST-Pull down技术检测HEK293T细胞中Daam1的活性，GST-RhoA融合蛋白起到“诱饵蛋白”的作用，“诱饵蛋白”能结合到带有谷胱甘肽的琼脂糖球珠上，带有活性Daam1的细胞裂解液经过琼脂糖球珠时会和GST-RhoA结合，进而挂在琼脂糖球珠上，经过洗脱去除其它杂蛋白，再经过高强度的洗脱把GST-RhoA+Daam1洗脱下来进行Western鉴定活性Daam1的存在。

第一行代表有活性的Daam1；第二行代表总的Daam1；GST列无条带表示：GST并不能与Daam1结合，从而排出假阳性的可能性。

GST-RhoA融合蛋白可以与Daam1结合，Western显示出条带，证实了Daam与GST相互作用。

加入GTPγS是为了活化RhoA，从而使其结合更多的Daam1进而提高整个系统的灵敏性和准确性。

实验严谨性分析：如果无GST条带，实验缺乏对照，如果Daam1也于GST结合，会对实验结果造成假阳性的结果。

如果无total Daam1条带缺乏内参对照。

备注：（文献中其他图）图1对于构建的表达载体插入的目的基因进行RCR鉴定，表明目的基因片段的存在。

图2 是对于编码RhoA的目的基因序列进行测序进而证实该基因正确的存在。

图3为GST-RhoA融合蛋白在大肠杆菌中的表达，通过考马斯亮蓝染色证实重组质粒在大肠杆菌中成功表达。

其中IPTG起到诱导RhoA蛋白表达的作用。

图4是对于重组蛋白GST-RhoA进行Western特异性检测，证实GST-RhoA在大肠杆菌中特异性、高水平表达。

表达载体构建1.获取目的基因从genebank中查询到海参溶菌酶基因（EF036468）原始序列，其247-684位是该序列的保守开放性阅读框（ORF）如下图：2.引物设计上游引物可从保守序列，即第247位开始选取连续的15-20个碱基，下游引物则从684位反向选取碱基（注意应为3的倍数，以避免移码导致阅读框的改变），估算两个引物的GC含量及Tm。

Tm可按以下公式估算：Tm=4（G+C）+2（A+T）。

一般Tm以55-80摄氏度之间为宜，GC含量在40%-60%之间。

引物的5端可以进行修饰，而3端不可修饰，这是因为DNA的合成是从5端向3端进行的。

因此引物的3端碱基序列应尽量与模板互补配对，尤其是最后的5到6个核苷酸序列。

此外，由于天然的原核表达载体上只有一个启动序列，为保证目的基因后的报告基因能正常表达，故引物的3端必须去除终止密码子，避免重组载体的蛋白表达停止。

5端可根据需要选择合适的酶切位点进行修饰编辑（目的基因应不含有该酶切位点）。

为了确保其酶切的特异性，可加入保护碱基，但要注意引物的长度不能过大，而使退火温度过高。

保护碱基的添加有专门的保护碱基对应表，可根据不同的酶切位点选择合适的保护碱基。

其他注意事项包括避免出现大量重复碱基、3端最后5个碱基不能出现多于2个G或C、避免出现同源二聚体、错配等等，引物设计完之后可进行Blast比对。

无误后引物合成。

3.PCR扩增目的基因4.琼脂糖凝胶电泳跑出条带后胶回收。

5.提取质粒6.对质粒和目的基因进行酶切和连接注意将目的基因连接在启动子/启动序列之后7. 鉴定一般包括：重组质粒的测序、双酶切的鉴定等。

酶活测定—分光光度法12、3、4、注意事项：一、 合适的底物，辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度1、 底物：对待测酶有较高的特异性；Km 值小，以使Vmax 时的底物浓度低，降低试剂成本，防止出现底物难溶现象；底物浓度合适，多数酶Km 在10-3—10-5 mol/L ，底物浓度最好为Km 的20—100倍，一般不可低于10倍2、辅因子、活化剂的种类和浓度：如辅酶、辅基、离子以及其他加速酶反应的物质3、变构剂的种类和浓度：边沟没的反应速度和底物浓度呈S形曲线，变构剂分为变构激活剂和变构抑制剂，影响变构酶和底物的作用速度，不同浓度的变构剂改变曲线的形状，测变构酶活性浓度时，一般在饱和浓度的变构剂的条件下进行二、选择酶最适反应系统1、缓冲体系的pH：最适pH时，V最大2、离子种类和强度3、温度4、其他影响酶活的因素：氧化剂，氧化酶蛋白中的甲硫氨酸、络氨酸、色氨酸残基使酶失活）；表面活性剂（Tween-80、Brig-35），抑制酶活；抑制剂三、确定反应时间选用产物生成与反应时间呈线性关系范围内的时间点为测定选用的时间四、酶液稀释度对酶活测定的影响稀释可能降低酶的稳定性，降低样品中原有抑制因素和辅因素的浓度，而且许多酶活力和稀释倍数成正比。

酶分子与底物分子的数量比列中有在适当的范围内时酶的活力与产物生成才成线性正比例关系。

稀释倍数过大影响酶的稳定性，A值过小结果偏低；稀释度低，吸光度太大，使结果大大偏低。

应使吸光值在0.2-0.5之间可得相对稳定的测定结果。

五、标准曲线制作时尽可能和样品在同一条件下反应，以减少系统误差。

吸光值和产物应为线性关系范围，酶样测定值在线性范围内。

六、显色剂的配制对酶活测定的影响显色剂的类型，其中各物质的配比、在反应中的添加量、显色时间七、对照系统设置对照体系，排除系统中非酶因素干扰，保证测定值的准确性。

离子交换层析分离纯化未知蛋白原理：离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

由于是未知蛋白，蛋白质的电荷性质、等电点和分子量等都是未知的，因此离子交换剂的选择和与缓冲液pH值的选择都需要探究。

1、离子交换树脂的选择依据被分离物质的性质和分离目的，保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。

一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离，碱性物质用阳离子交换剂分离。

类型包括：阴、阳离子交换树脂、强离子交换树脂和弱离子交换树脂；层析时液相流速要适中，让蛋白有足够的时间吸附在树脂上；树脂吸附容量在10%-20%，一般选用强离子交换树脂，它能够提供更好的重现性。

2、缓冲液pH值的选择首先未知蛋白不能与缓冲液发生反应，其次是确定蛋白质等电点，最常用的方法是等电聚焦电泳。

通过氨基酸序列推测出的等电点常与表观等电点相差一个单位。

当蛋白质因不纯而不能进行等电聚焦电泳时，要确定溶液PH值得简单方法步骤如下：（1）在九个试管中各放入1ml阴性离子交换树脂（如DEAE Sepharose CL-6B）（2）用10ml 0.5mol/L，pH值为5.0的缓冲液润洗一号试管10次后；加入含10mmol/L NaCL的缓冲液平衡树脂。

二号试管以pH值为5.5的缓冲液同法处理；以后各试管所用缓冲液pH值依次增加0.5个单位。

（3）去掉多余缓冲液，保证各试管中缓冲液高出树脂量为1ml。

（4）向各试管中加入100ul蛋白质溶液。

（5）混匀试管中物质，放置几分钟。

（6）检测上清中是否存在目的蛋白。

（7）上清中不存在目的蛋白就是所需PH 。

3 装柱先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定;将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜。

4 平衡缓冲液平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。

平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。

其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。