细胞分裂、 分化调节
培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.5mg/L
单细胞或细胞细胞团块的获得
方法（机 械和酶法）
液体培养
细胞活力 细胞分裂和生长 分化和代谢调节
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做今天实验之前:
►前面实验的观察和数据收集 ------胡萝卜愈伤组织的诱导和生长反
应的观察 ►植物细胞工程实验部分实验报告的
胡萝卜愈伤组织悬浮培养体系 的建立和胡萝卜愈伤组织再分
化的诱导
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一、实验目的
• 学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法 和相关操作。
• 通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个 过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培 养技术生产有用次生代谢物这一个技术的 主要流程，技术体系和注意事项。
• 学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和 方法。
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二、实验原理
植物细胞的悬浮培养
• 胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂， 细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理 调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以 诱导疏松性愈伤组织的产生。
• 利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块， 可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养 体系，并在此基础之上进行培养物的继代和 保持，进行有用次生代谢物的生产。
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个人观点供参考，欢迎讨论！
撰写
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污染源: 细菌,霉菌?现象?
Hale Waihona Puke • 观察生 有污染 长 反 应 无污染
原因: 外植体?环境?操作?
不生长,发白或死亡
不生长,不死亡,也无愈伤形成 发生部位
愈伤形成 颜色质地 差异原因?
• 拍照
• 分析
8
形式
综合性的一篇论文 分开的三次实验报告
实
验
结构上的完整性
报
文字 术语的正确使用
告
内容
图片
不同污染源导致的污染 不同生长情况的图片 不同愈伤组织的图片
3
由固体培养转向液体 培养，对细胞而言有 什么差别？
细胞悬浮培养的目的 和所需要的条件？
一个好的培养体系具 备什么样的特征？ 4
愈伤组织再分化的诱导
• 培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT
0.2mg/L
• 培养条件： ？
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三 实验操作
1.悬浮培养体系的建立
外植体
无菌 脱分化
愈伤诱导 愈伤继代
甲醇萃取 β-胡萝卜素
乙醚纯化 β-胡萝卜素 β-胡萝卜素含量的测定
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悬浮细胞的收集
用纱布/滤纸过滤培养液收集细胞
待溶液完全过滤后称纱布/滤纸和细胞的重量
将细胞转移入圆底烧瓶后再次称纱布/滤纸重量 计算细胞鲜重
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甲醇萃取 β-胡萝卜素
将收集好的细胞放入圆底烧瓶中 每克试样加10ml含10%KOH的甲醇溶液 水浴上加热(64.8度以上)避光回流30min
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乙醚纯化
上清液（约10ml）放入分液漏斗 加入150ml乙醚振荡摇匀，静止分层
去除下层甲醇，保留上层乙醚溶液
倒入蒸馏瓶，蒸去乙醚，
残留物用4-5ml己烷溶解
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含量的测定
在波长452nm下测定吸光值A452。
• 己烷中的β-胡萝卜素在波长452nm 下的摩尔消光系数ε1cm1%=2500 ，即溶液的OD452为0.25时每ml含 β-胡萝卜素1μg。
数据
存活率 污染率
分析讨论 污染原因的分析 实验结果的分析
思考和讨论
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具体操作：
1.悬浮培养 选择疏松性愈伤组织
• 8人/组 • 2瓶悬浮培养基/组 • 约1g 细胞/瓶
无菌条件下将愈伤组织的细胞轻轻地剥离和分开
单细胞或小细胞团块
接种入已预先称重的液体培养基,接种后再次称重,获得细胞的鲜重(1g 左右)
悬浮振荡培养1周或更长
称重,计算细胞鲜重的增加(?g )
收集细胞,分离-提取-纯化胡萝卜素,并测定含量
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2. 再分化诱导
• 8人/组 • 2-3瓶/人
建立起来的无菌培养物
无菌条件下切割分开
接种在分化培养基上
适当条件下培养1-3周 培养反应的观察
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3 胡萝卜素的分离提取和含量测定
悬浮细胞的收集