10
3. 步骤: a: 第一次染色后, 除去抗体和 酶而使有色反应终产物留在 抗原部位, 再用同样方法进行 第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及 NGS封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. 氧化法洗脱. TBS洗. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS 洗. 甘油胶封片.
大鼠垂体前叶促性腺激素细胞 (蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫酶(PAP法)双重染色. 1993.
11
b: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部位. 用有 机溶剂将反应终产物溶解除去, 洗脱抗体复合物, 然后进行第 二次染色. 对同一部位再一次照相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗. *. TBS封片, 照相(注意防止切片干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反 应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, TBS洗. *. PAP法第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS洗. *. 甘油胶封片, 找出第一次照相的部位, 再次照相.
8
假性双标的来源
第一次用ABC法染色, 氧化法洗脱抗体. 对照 试验证实此为假性双标. 1992.
9
2. 抗体洗脱法: a. 酸洗法: 在pH2.2甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二 甲基甲酰胺(Dimethylfomamide, DMF), 作用1~4小时使抗原-抗 体复合物解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧 化除去抗体, 0.5%偏重亚硫酸钠 (Sodium Metabisulfite, Na2S2O5)漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对第二种 抗原的影响(可设立对照). c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小 时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.
6
Texas red- 2nd anti-insulin, FITC-2nd anti glucagons in mouse pancreas.
Alexa Fluor 568-2nd anti-giantin in G, Alexa Fluor 488-2nd anti-NPCP, Alexa Fluor 350-phalloidin. Tahr Ovary Epithelial Cells (HJ1.Ov Line).1st antibodies shows EEA1, Alexa Fluor 568-1st antibodies shows beta-tubulins. Cultured 18embryonic day rat hippocampal neurons..
3
B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自 不同种属的动物如兔和豚鼠 (Guinea pig). 2. 两种来源于同种动物或不 同种动物的二抗(如羊抗兔 IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以 FITC和TRITC标记. 3. 染色步骤: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第 一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育 切片, 显示第二种抗原. 或者将两种一抗混合后孵育切片, 再 将两种标记的二抗混合后孵育切片. b. 其余同前.
第八章. 免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry) 用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两 种以上的抗原, 以发现其定位, 形态和功能上的相互关系. I. 连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切 片上各自显示一种抗原, 然后比较. 不会互相干扰或出现 假双标. B. 切片厚度1~3m, 否则不能确保双阳性结果. 神经组织 切片10~20m, 可采用“镜像”法 即相邻切片翻转后贴在 载玻片上, 软件PS处理. II. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的 抗体, 显示不同的颜色.
5
Texas Red-2nd anti-histone, Alexa Fluor 488-2nd anti-PMP70 in peroxisome, Alexa Fluor 350phalloidin. Indian Muntjac deer skin fibroblast cell.
FITC-2nd anti-microtubules, TRITC-2nd anti-actins, DAPI shows nucleus in cultured Bovine pulmonary artery endothelial cells.
4
COS7 cells, Y.W Lin. Nuclei were stained by Hoechst blue, USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594. Mixed color is yellow.
1
A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~5→520~30nm, 绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)或其他荧光染料分别标记的两种一 抗混合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行 观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗 原的细胞(呈绿色或红色). 如果两种抗原存在于同一个细胞 或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.
7
III. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 常见于两种一抗来自同种属动物. 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的电 子供体如DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两重染色之间需将第 一次染色反应中的各级 抗体和酶(步骤a)及其反 应产物从组织上洗脱 (步骤b). c. 连续做两次染色, 所 费时间较长.