冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约
10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS
冲洗，2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或
TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵
育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9. 显色剂显色（DAB或AEC）。
10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
荧光抗体染色方法
免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。
所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小，不溶解或不变性，原有
位置不扩散或不移位。
因此，对标本的处理一般速度要快，温度要低。
恒冷切
片和涂片较为理想。
因此，抗体溶液的pH值和反应温度越低，孵育的时间越长。
一般37℃时需要25~60分钟。
若要作细致观察或者当天不能进行染色标
本的观察，可在5℃中过夜，但染色标本最好是当天观察。
1、直接染色法
直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，是免疫荧光技术
中最基本、最简单的染色方法。
（1）固定：切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。
（2）冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
（3）染色：滴加相应的荧光抗体液，将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
（4）冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
（5）观察：标本晾干或者加介质（缓冲甘油液）和盖片观察。
直接法首次试验时需作以下对照：
标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，呈阴性反应。
标本先加同类未标记抗体作用30分钟后，PBS冲洗，再加荧光标记抗体染色。
因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应，不再与荧光抗体结合，所以应呈现
阴性反应。
2、间接染色法
间接染色法分双层法和夹层法
（1）双层法：双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。
①固定：标记用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
③第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱
布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本滴加荧光抗体（抗体Ⅱ）液，再放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。
首次试验时需作以下对照：
①标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，呈阴性反应。
②标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，再加抗免疫球蛋白荧
光抗体溶液染色。
因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
（2）夹层法：夹层法主要示踪细胞内的免疫球蛋白
①固定：标本用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：PBS冲洗。
③第一次作用：标本首先滴加与标本内抗体相应的抗原，放湿搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本加标记的荧光抗体溶液，放入湿搪瓷盒中，在37℃
作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。