黄嘌呤氧化酶抑制剂/超氧阴离子清除剂双靶点高通量筛选模型的建立谢涛†, 秦至臻†, 周睿, 赵赢, 杜冠华*(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室, 北京 100050)摘要: 本文建立了适用于同时筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的双靶点高通量复合筛选模型。
在黄嘌呤氧化酶超氧阴离子生成体系中,加入WST-1作为超氧阴离子生成量的探针,以反应体系中标识性产物尿酸为黄嘌呤氧化酶活性指示剂, 采用SpectraMax M5酶标测试仪, 同时检测两种指示剂的浓度变化, 通过对反应体系中的影响因素进行优化建立双靶点HTS筛选模型, 并利用阳性药物对该模型进行评价。
在反应体系中, 反应终体积50 μL, 黄嘌呤氧化酶4 mU·mL−1、黄嘌呤250 μmol·L−1、WST-1浓度为100 μmol·L−1, 黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选模型的Z'-因子为0.5374, S/N为47.5199; 超氧阴离子清除剂筛选模型的Z'-因子为0.5074, S/N为5.3889。
结果表明, 本文建立的黄嘌呤氧化酶抑制剂/氧自由基清除剂高通量筛选模型具有稳定性好、成本较低和重复性高等特点, 可以广泛应用于药物筛选。
关键词: 高通量筛选方法; 黄嘌呤氧化酶; 超氧阴离子清除剂; 抗氧化; 药物评价中图分类号: R965 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2015) 04-0447-06 Establishment of double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengersXIE Tao†, QIN Zhi-zhen†, ZHOU Rui, ZHAO Ying, DU Guan-hua*(Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identification and Drug Screening, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)Abstract: A double targets of high throughput screening model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers was established. In the reaction system of xanthine oxidase, WST-1 works as the probe for the ultra oxygen anion generation, and product uric acid works as xanthine oxidase activity indicator. By using SpectraMax M5 continuous spectrum enzyme sign reflectoscope reflector, the changes of these indicators’ concentration were observed and the influence factors of this reaction system to establish the high throughput screening model were studied. And the model is confirmed by positive drugs. In the reaction system, the final volume of reaction system is 50 μL and the concentrations of xanthine oxidase is 4 mU·mL−1, xanthine 250 μmol·L−1 and WST-1 100 μmol·L−1, separately. The Z'-factor of model for xanthine oxidase inhibitors is 0.5374, S/N is 47.5199; the Z'-factor of model for superoxide anion scavengers is 0.5074, S/N is 5.3889. This model for xanthine oxidase inhibitors and superoxide anion scavengers has more common characteristics of the good stability, the fewer reagent types and quantity, the good repeatability, and so on. And it can be widely applied in high-throughput screening research.Key words: high throughput screening method; xanthine oxidase; superoxide anion scavenger; antioxidant;drug evaluation收稿日期: 2014-10-20; 修回日期: 2014-12-22.基金项目: 重大新药创制科技重大专项 (2012ZX09101); 国际合作项目 (2012DFH30070).†并列第一作者.*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-63165184, E-mail: dugh@痛风是目前常见严重的代谢性疾病, 以高尿酸血症为特征并通过尿酸在关节处形成晶体, 引起与自由基损伤相关的组织损伤, 危害患者运动功能并引起巨大痛苦。
黄嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase, XO)[1]是一种黄素蛋白酶, 存在于多种生物体中, 可催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸, 在此过程中伴随着超氧阴离子的产生[2]。
当体内XO活性过高, 引起尿酸生成过多, 将导致高尿酸血症, 进而引发痛风[3, 4]。
黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌醇通过抑制体内XO的活性而减少尿酸生成, 对高尿酸血症和痛风产生良好的防治效果[5]。
近年又发现, 黄嘌呤氧化酶抑制剂对缺血再灌注损伤[6]、内皮损伤[7]和心功能衰竭[8]具有明显的保护作用, 有可能成为治疗心血管系统疾病尤其是心衰的药物。
虽然XO抑制剂具有现实和潜在价值, 但临床应用的该类药物品种极少, 而且别嘌醇作为嘌呤类似物, 对人体正常嘌呤代谢也会产生不良影响[9], 限制了其应用, 因此发现和寻找具有新结构的XO抑制剂具有重要的现实意义。
在正常状态下, O2・－自由基作为新陈代谢的活性中间体, 在生物体中保持相对稳定的动态平衡。
细胞自身具有一定的O2・－清除能力。
细胞色素c[10]、超氧化物歧化酶等可以将其转化为无害物质。
当细胞受到外界刺激或发生病变时会产生过量的O2・－引起氧化应激, 引起多种生理病变[11]。
在痛风患者体内, 次黄嘌呤和黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶作用被氧化成尿酸过程中会产生大量的超氧阴离子[12], 继而引起氧化和抗氧化体系失衡, 故痛风患者发生心脑血管疾病的可能性也大为提高[13]。
因此, 异常状况下O2・－的清除对于维持正常的生理活动具有重要意义。
近年来, 陆续报道了关于评价黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的方法。
黄嘌呤氧化酶抑制剂活性的测定可以通过定量测定酶的反应产物尿酸以及超氧阴离子的含量。
尿酸的含量可以通过分光光度法[14]或液相色谱法[15]的方法来定量。
超氧阴离子可通过化学发光方法[16]或光谱法进行定量。
电子自旋共振法也可用于检测和量化超氧阴离子[17]。
这些方法有时也被用来评估超氧阴离子清除活性化合物。
然而, 上述方法不能同时测定化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧化物清除活性, 且一些方法容易得到假阳性和阴性结果。
刘书等[18]利用UHPLC- TQ-MS方法实现了黄嘌呤氧化酶抑制剂活性和超氧阴离子清除活性的同时检测, 这种方法虽然灵敏, 但操作较复杂, 且成本较高, 不能满足快速大量的高通量筛选的要求。
本研究利用自动加样器和384微孔板, 通过酶标仪检测紫外与可见光吸收, 可以实现化合物黄嘌呤氧化酶抑制活性和超氧阴离子清除活性的双重评价。
材料与方法试剂丹酚酸A (salvianolic acid A, SAA), 中国医学科学院药物研究所新药筛选中心自制, 批号20101109; 黄嘌呤 (xanthine, Xan), 批号95490, 购自Fluka公司; WST-1, 生产批号EQ756, 购自日本Dojindo Laboratory公司; 焦磷酸钠, 批号L590L06, 购自Amethyst Chemicals公司; 别嘌呤醇 (allopurinol, Allo), 批号A8003, 购自北京华迈科生物技术有限责任公司; 黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO), 批号SLBB1570V, 购自美国Sigma Aldrich公司; EDTA, 生产批号20120412, 购自国药集团化学试剂有限公司。
仪器SpectraMax M5连续光谱酶标测试仪 (MD 公司); Corning 384孔紫外板 (Corning Incorporated公司); Mini Sharkeer (MH-1, Kylin-Bell Lab Instruments 公司); Purelab Plus型超级应用型超纯水器(美国PALL公司)。
试剂配制0.1 mol·L−1焦磷酸钠缓冲液 (Buffer) 用双蒸水配制0.1 mol·L−1焦磷酸钠溶液, 含0.3 mmol·L−1 EDTA, 超声溶解, 调pH 8.3, 现用现配。
WST-1工作液双蒸水配制WST-1储备液 (6.51 g·L−1), 避光4℃保存; 取WST-1储备液288 μL+Buffer 6912 μL混匀, 避光, 现用现配。