园艺学报 2014，41（8）：1689–1698 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2 finger基因的克隆与表达分析金晓琴，康振，刘伟娜，潘永娟，王梨嬛，郭卫东，杨 莉*（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004）摘 要：在26S泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解过程中，RING finger蛋白是一类特殊的泛素蛋白连接酶，参与植物多个生长发育及逆境胁迫响应过程。
为探明柚RING finger家族成员的序列特征及表达模式，从红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实汁胞中分离出两个RING finger基因cDNA片段（CgRHF1和CgRHF2），采用实时荧光定量PCR研究其在不同组织及果实发育不同时期的表达模式。
结果表明，两个基因均属于RING-H2 finger家族成员，且红肉蜜柚与琯溪蜜柚的两个CgRHF之间碱基序列均无差异；除根组织外，CgRHF1表达水平较CgRHF2高，且在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达水平显著高于琯溪蜜柚；CgRHF2在组织及果实发育过程表达水平均较低，但在果实成熟采摘阶段急剧上升。
CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能，而非功能互补基因。
关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；RING-H2 finger基因；克隆；基因表达中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1689-10 Isolation and Expression Analysis of Two Ubiquitin-protein Ligase RING-H2 Finger Genes from Pommelos[Citrus grandis（L.）Osbeck]JIN Xiao-qin，KANG Zhen，LIU Wei-na，PAN Y ong-juan，W ANG Li-huan，GUO Wei-dong，and Y ANG Li*（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua，Zhejiang 321004，China）Abstract：RING（Real Interesting New Gene）finger proteins specify the substrates in the 26S ubiquitin-proteasome pathway，and play important roles in plant development and stress responses. However，the sequences，expression characteristics and physiological functions of RING finger genes in pommelo are little known. In this study，two RING finger（CgRHF1 and CgRHF2）cDNA fragments were isolated from Red-fleshed and Guanxi pommelo. The results showed that two CgRHFs were belonged to RING-H2 finger subfamilies，and there is no DNA base difference in the sequences of two cultivars. Quantitative real-time PCR results showed that gene expression of CgRHF1 is significantly higher than CgRHF2，especially in the stems，leaves and flowers of red-fleshed pommelo. The expression levels of CgRHF2 were relatively low in the tissues and fruit development of two pommelo cultivars，but dramatically increased at the fruit mature stage. This study has implied that CgRHF1 and CgRHF2 may play different roles in the tissues and fruit development of Red-fleshed and Guanxi pommelo，and can not functionally complement.收稿日期：2014–03–04；修回日期：2014–07–22基金项目：国家自然科学基金项目（30900978）；浙江省自然科学基金项目（LY14C150001）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：yangli@）1690 园艺学报41卷 Key words：red-fleshed pommelo；Guanxi pommelo；RING-H2 finger gene；clone；gene expression26S泛素蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway）是已知真核生物中主要的蛋白质降解途径，通过调节功能蛋白周转和降解异常蛋白，实现对多种代谢过程的调节，在细胞周期、信号转导、细胞分裂与分化、胁迫反应和细胞程序性死亡等细胞生理活动中起重要作用（Frescas & Pagano，2008；Bedford et al.，2009；Hochstrasser，2009；Navon & Ciechanover，2009）。
泛素蛋白酶体途径的具体过程是：由ATP提供能量，泛素激活酶（ubiquitin-activating enzymes，E1）激活泛素，并将泛素转移至泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes，E2）的活性位点半胱氨酸（Cys），形成E2–泛素复合物；泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases，E3）能识别靶蛋白，将E2和靶蛋白在空间上拉近，促进E2将泛素转移至靶蛋白，或是E2将泛素转移至E3，由E3转移泛素至靶蛋白。
当靶蛋白泛素化水平达到一定程度后，转运至26S蛋白酶体进行降解（Moon et al.，2004；Li et al.，2011；Wang & Deng，2011）。
26S泛素蛋白酶体途径是目前已知的具有高度选择性的蛋白质降解途径，是生命过程进行精确时空调控的重要方式（Hochstrasser，2009），拟南芥中约有5%的蛋白质参与该途径（Stone et al.，2005）。
26S蛋白酶体主要存在于细胞质与细胞核，识别泛素化的蛋白并将其降解是一非特异性的过程。
因此E3连接酶在此过程中发挥了至关重要的作用，决定反应的特异性。
在泛素介导的选择性蛋白降解途径中，E3连接酶是识别靶蛋白N端不稳定氨基酸信号的关键酶（宋素胜和谢道昕，2006；Budhidarmo et al.，2012）。
目前发现的E3连接酶主要有HECT（homologous to E6-AP carboxy terminus）结构域家族、RING（Real Interesting New Gene）finger结构域家族和U-box（Ubiquitin chain elongation factor）结构域家族3大类。
其中RING结构域家族是一个庞大的蛋白家族，其环指结构域（RING finger domain）是RING finger类蛋白具有E3连接酶功能的重要结构。
标准的RING finger蛋白包含1个至多个特定位置的Cys和组氨酸（His）残基组成的锌指结构域，由两个Zn2+和相应的氨基酸残基形成“cross-brace”结构，将E2和靶蛋白拉近，从而使E2–泛素复合物上的泛素高效地转移至靶蛋白（Lecker et al.，2006；Metzger et al.，2012）。
根据Zn2+结合残基Cys和His的数量与位置不同，RING finger家族又可分为RING-HC、RING-H2、RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T、RING-G、RING-mH2和RING-mHC 9大亚类（Li et al.，2011）。
现有研究表明，RING finger蛋白家族成员独立或以多亚基复合体的形式在光形态建成、激素反应、生理节奏、胁迫反应、种子粘液、木质化以及花的发育等过程中起到十分重要的作用（Osterlund et al.，2000；Ma et al.，2002；Molnar et al.，2002；Xu & Li，2003；Guo & Ecker，2004；Moon et al.，2004；Seo et al.，2004；Kepinski & Leyser，2005；Serrano et al.，2006；刘辉志和韩世平，2010；李彦泽，2011；Wang & Deng，2011）。
Welsch 等（2007）发现包含RING finger结构域的SINAT2（SEVEN in ABSENTIA of Arabidopsis2），可能与转录因子AtRAP2.2共同调控拟南芥类胡萝卜素含量，是否存在其他E3连接酶参与调控植物类胡萝卜素的生物合成与代谢尚不清楚。
此外，本实验室前期基因芯片分析发现一个RING-H2 finger基因在琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚中的表达具有较大差异。
作者从两种蜜柚中分别分离出两个RING-H2 finger基因，研究其在不同组织及果实不同发育时期的表达规律，为进一步研究该基因在特异靶蛋白选择性降解过程中的作用，以及红肉蜜柚果实变异的分子机制提供基础。
1 材料与方法1.1试验材料供试材料为福建省平和县小溪镇锦盛公司育种基地的10年生琯溪蜜柚及其红肉早熟突变体红8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2 finger基因的克隆与表达分析 1691肉蜜柚。
于2012年4月采集幼嫩的须根，春梢（茎），完全伸展的叶片，盛花期的全花，以及盛花期后75、105、135、165和195 d的果实汁胞，样品用液氮速冻后于–80 ℃贮存备用。