现代生物技术在食品检测中的应用潘云娣　杨文鸽(宁波大学生命学院,宁波　315211)摘　要:　介绍了DNA探针、PCR技术、免疫检测技术在食品微生物及转基因成分检测中的应用。

着重阐述了PCR技术的工作原理、应用及其发展前景。

同时简要介绍了生物芯片及其在食品检测中的应用前景。

关键词:　DNA探针　PCR技术　免疫检测技术　生物芯片The Application of Modern Biological T echnologies in Food T estingPan Yundi　Yang Wenge(L if e College Ni ngbo U niversity,Ni ngbo　315211)Abstract:　The application in food microorganisms and GMO identification of four modern molecular biology tech2 niques were introduced:DNA probes,PCR technique,immunological examination,biochip.The principle,application and development prospect of PCR technique were especially detailed discussed.The biochip and its application prospect were also presented.K ey words:　DNA probes　PCR technique　Immunological examination　Biochip 随着我国食品科学技术的发展以及对外贸易的需要,食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。

特别是为了保证食品的标准品质,开展食品科学技术研究,寻找食品污染的根源,人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害、有毒物质的检验和分析。

我国目前采用的食品检验方法还比较落后,已不能适应人们对食品卫生和安全的需求。

因此,改进和完善食品检测技术已迫在眉睫。

自1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋模型,揭示了遗传密码的奥秘。

进入20世纪70年代,各种分子生物学技术不断出现,主要包括核酸分子杂交技术、PCR技术和现代免疫技术等,目前这些技术在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用;另外,生物芯片技术也在食品检测方面显示了较好的应用前景。

本文就这些技术尤其是PCR技术在食品检测方面的应用与特点作一探讨。

1　DNA探针法两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列,就能够特异性的结合而成为分子杂交链。

若在已知的DNA或RNA片断上加上可识别的标记(如用32P同位素标记),就可制成DNA探针,用以检测未知样品中是否具有与其互补的序列[1]。

目前使用的DNA探针杂交方法总体上可以分为2类:一类是异相杂交(即固相杂交技术)。

二是同相杂交(即液相杂交技术)。

近年来DNA探针杂交技术在食品微生物检测中的应用研究十分活跃,目前已可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(S al monella)、志贺氏菌(S higella spp)、李斯特氏菌(L isteria monocyto2 genes)、金黄色葡萄球菌(S taphylococcus an2 rens)[2,3,4]等。

1991年周志江[5]等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的DNA片断作为基因探针,检测了污染食品中的产ST大肠杆菌。

1993年3月陈倩[6]等对自食品中以血清学初筛分离出的78株ESIEC菌株,以入rp2z基因探针检测其HPI毒力岛基因,结果检出7株,可鉴定为ESIEC大肠杆菌。

本法特异、敏感而又没有放射性,且不需要进行复杂的扩增菌和获得纯化培养而节省了时间,从而减少了毒力丧失的机会,提高了检测的准确性。

2　PCR技术PCR技术是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。

该技术自问世以来,就以惊人的速度广泛生物技术通报・技术与方法・ B IO TEC HNOL O G Y　BULL ETIN 2004年第6期地应用于生物及食品学科的众多领域,在食品中致病微生物及转基因成分的检测方面也有潜在的应用价值。

2.1　PCR技术的基本原理简单地说,PCR的基本原理是在体外对特定的双链DNA片段(靶DNA)进行高效扩增,故又称基因体外扩增法。

在体外合适条件下,先将靶DNA 变性成为单链,然后加入人工设计与合成的两段寡核苷酸引物,在热稳定的DNA聚合酶和4种dN TPs底物存在的条件下,这对引物沿靶DNA按5′→3′方向延伸,合成新的DNA双链。

新合成的DNA双链又可作为扩增的模板,继续重复以上的DNA多聚酶链式反应。

2.2　PCR技术在食品检测中的应用2.2.1　PCR技术在食品致病微生物检测中的应用PCR技术用于食品中致病微生物的检测较之传统方法具有快速、特异、敏感等特性,其优越性无可比拟,因而该技术在食品致病菌的检测方面具有很大的应用前景。

单核细胞增生性李斯特氏菌:单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)对牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。

传统的检测方法存在周期长、操作繁琐等不足之处。

孙焕东[7]等采用裂解法提取DNA,应用半套式PCR对其进行检测,设计合成的引物可特异地将其扩增,并对其它菌不产生反应,显示了较强的特异性。

从敏感性看,检测限度可达到10个U FC以下,较之常规PCR检测有所提高;同时,检测只需要5～6h,较之传统方法快得多。

杨百亮[8]通过对TaqDNA聚合酶和引物浓度等条件的标化,建立简便实用的快速检测牛奶中单核细胞增多性李氏菌试剂盒,具有良好的应用前景。

肉毒梭菌:食品中肉毒梭菌是引起肉类中毒的潜在因素。

用常规方法从食品中分离鉴定肉毒梭菌至少需要4天,不能达到快速检测的目的。

王颖群[9]等通过检索肉毒神经毒素的基因序列,选择保守区设计简并引物,用以同时扩增A、B、E和F型毒素的基因。

由于肉毒梭菌中毒标本极少,因而用A、B、E和F型肉毒梭菌人工感染10种食品以制备模拟标本,采用适当方法处理后进行PCR检测,实现了快速、敏感、特异检测的检测结果。

但由于肉毒梭菌中毒最终由肉毒神经毒素引起,而PCR只能检测肉毒梭菌的存在与否,因而对食品肉毒梭菌和毒素并存,或有菌无毒的情况,PCR检测不具确定的诊断结果,只具参考价值。

沙门氏菌:沙门氏菌是温、冷血动物的肠道菌,分布范围广泛,是食物中毒的常见原因之一。

利用PCR技术对沙门氏菌进行检测同样具有传统常规培养法所不具有的快速、简便、特异性强等特点。

P.Whyte[10]等人分别采用传统方法与PCR技术对生禽肉中沙门氏菌进行检测发现,采用传统方法检出了16%的样品被沙门氏菌污染,而运用PCR技术则检出了19%的污染样品,可见PCR技术的敏感性更强。

而当两者结合使用时,这一数字上升到了23%。

几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子(irvA),以此遗传因子为目标的沙门氏菌(Prime PCR screening kit)由日本鉴酒造株式会社在市场上销售,用它不需要特别的技术,就可以高灵敏度地检测出沙门氏菌遗传因子,从而检测出沙门氏菌。

弧菌:副溶血弧菌是海洋和盐湖中微生物区系的重要成员。

水产品常常自身携带该菌,因而给该菌在水产品加工中的预防带来难度。

有人[11]对相关食品进行副溶血弧菌增菌后,分别用新建的PCR 方法和常规培养法进行平行比对实验,以评价PCR 方法与常规生化法的符合程度,发现结果完全相符,说明PCR法的准确与可靠性。

而PCR法在操作、周期长短、灵敏度、检测成本等方面显然具有更大的优越性。

除上述几种食品致病菌外,PCR技术还可用于顽固性梭状芽孢杆菌、葡萄球菌肠毒素等的检测[12],且同样具有较高的特异性、敏感性。

2.2.2　PCR技术在食品转基因成分检测中的应用随着现代分子生物学技术的飞速发展,转基因食品日益走进我们的生活。

但是随着转基因食品逐渐走上人们餐桌的同时,其安全性也日益受到普遍关注。

这是由于转基因食品中通常会有新的遗传物质(NDA)和蛋白质,而这些物质在传统的食品中或许不存在[13]。

因此,为了保障人类的身体健康,消除消费者顾虑,有利于国际贸易和商品流通,建立快速、简便、准确的转基因检测方法非常必要。

722004年第6期 潘云娣等:现代生物技术在食品检测中的应用目前,转基因食品的检测方法主要有三种:核酸检测法、蛋白质检测法、酶活性检测法。

每个方法都有各自的特点和不足,而PCR仍然是最常用以及最适用的检测转基因食品的方法。

这是由于PCR法不同于蛋白质法和酶法,后两者一般不能用于加工后产品的检测,因为蛋白质已变性,而PCR法则不受此限制。

已有文献报道[14]在借鉴几种传统定量PCR方法的基础上,建立了一种新的实时荧光定量PCR法对转基因产品进行检测。

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程。

最后,通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。

该法有效地解决了传统定量方法所存在的假阳性及准确度不高的难题。

Farid E.Ahmed[15]则采用了另一种PCR方法———Q2PCR(qualitative PCR)对食品中的转基因成分进行检测后认为该法特异性强,敏感度高,并且灵活性强,对任何食品中的转基因成分都能进行较低含量水平的检测。

如果预先设定食品中转基因成分的下限值(阈值),那么可以利用该法检测出的GMO水平是否高于该阈值来决定是否对产品进行转基因标签。

2.2.3　PCR检测方法的问题及展望采用PCR技术对食品中致病微生物及转基因成分进行检测的方法虽然具有特异性强、敏感度高、简便快速等优点,但也存在不少问题。

首先就是假阳性结果的产生。

PCR是一种极为灵敏的反应,一旦有极少量外源性DNA污染,就可能出现假阳性结果,而样品间的交叉污染或时间延长也会导致PCR产物的假阳性产生。

因而在PCR检测过程中必须严格操作,并设立阴性对照,保证检测结果的准确性。

第二是引物的问题。

目前,PCR引物的合成是该技术普及的最大障碍,有待进一步改善才有希望成为食品微生物常规检测技术之一。

此外,各种实验条件控制不当或靶序列的选择不当等,都可能导致产物突变或降低其灵敏度和特异性。

因而,稳定性也是PCR技术必须改进的问题之一。

之前所述的实时荧光定量PCR法虽然克服了假阳性及定量准确度不高的难题,但是由于荧光定量PCR仪价格昂贵,暂时也难以普遍推广。

因此,如何利用与其他技术的结合使PCR成为一种稳定、灵敏、易操作且成本低廉的技术将是今后研究的主要内容之一。