电泳技术与应用一．电泳的基本原理：生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。

常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。

在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即电泳。

二．电泳的主要类型1.醋酸纤维薄膜电泳原理：醋酸纤维素薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维素薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。

醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象。

又因膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分有样品传到，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5ug的蛋白质可得到满意的分离效果。

因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。

优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（20min-1h)；③它对各种蛋白质(包括血清蛋白、溶菌酶、核糖核苷酸）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。

操作过程中应注意事项：由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必须在密闭的容器中进行，并使用较低电流避免蒸发。

应用：广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等地分离分析中。

尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单、快速等优点。

2．琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中优点：①适用于大分子物质的分离如核酸大分子蛋白质②兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用③琼脂糖凝胶制备容易，分离范围广注意事项：①注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象②注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

③对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

④注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

另外还需注意几点：如电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象；DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象；正确的DNA上样量是条带清晰的保证。

注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。

TIANGEN 公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带；DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。

Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确；注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。

应用：常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。

3.SDS-PAGE原理：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

PAGE胶聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。

此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）激发的。

被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

优点：①可以把目标分子按分子量大小分开②可以通过调整胶浓度调整迁移速率③可以方便地染色，转印，干胶保存常见问题：（1）.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验（2）“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

（3）为什么带出现拖尾现象？主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。

（4）为什么带出现纹理现象？主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

（5）什么是“鬼带”，如何处理？“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。

但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来（6）为什么溴酚蓝不能起到指示作用？我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。

主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

（7）为什么电泳的条带很粗？电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；（8）浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。

前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

（9）凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？通常胶在30MIN-1H内凝。

如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。

如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

（10）电泳时间比正常要长？可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

（11）.分离胶加上后为什么要立即加水？加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

4.双向电泳原理：先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。

然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。

样品中的蛋白经过等点电和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。

值得注意的是，双向电泳分离的结果使蛋白质点而不是条带。

根据Cartesin坐标系统，从左到右是pI的增加，从下到上是分子质量的增加。

优点：⑴对未处理样本耐受性好⑵不需要预纯化(如：色谱层析)⑶分辨率非常高⑷2D 可以有效的组分收集器⑸蛋白在凝胶介质中受到保护⑹在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）⑺与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多⑻与后续分析技术兼容性好注意事项及问题：重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？一般情况下是可以的。

但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。

所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。

为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。

由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。

如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。

为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。

跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。

电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。

当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。

跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。

所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。

由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。

当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。

跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。

溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。

溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。

跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。

跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。

这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。

跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。