溶菌酶的提取及系列性质的测定摘要本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。

通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。

关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定溶菌酶的简介溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。

在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。

实验目的：1、了解酶的基本研究过程。

2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。

3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。

I．实验准备一实验目的1.熟悉并了解整个实验流程。

2.熟练掌握各种溶液的配制。

二实验仪器及材料仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。

材料：新鲜鸡蛋。

试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.三试剂配制(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】(2) 2mol/L NaOH；200ml(3) 2mol/L HCl；200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝0.5mL2-β-巯基乙醇0.5mL蒸馏水 2.5mL注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。

II．溶菌酶的提取及纯化一、实验原理离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。

树脂的网状结构的骨架部分一般很稳定，对于酸，碱和一般溶剂都不起作用，且不溶于这些溶剂中。

这种网状结构的骨架上有许多可以被交换的活性基团。

按可以被交换的活性基团的不同，离子交换树脂可分成阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

二、实验步骤及流程图三、实验结果记录蛋清样品制备：鸡蛋两个，破壳取蛋清，加入1.5×0.1mol 磷酸盐缓冲液（PH=7.0），搅拌均匀。

八层纱布过滤两次，取上清液，量取记录体积V 1留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装1号管中，-20℃备用阳离子交换树脂再生：50gAmberlite-CG-50 阳离子交换树脂先用2mol/lNaOH 浸泡30分钟，水洗至中性，再用HCl 浸泡30分钟，水洗至中性。

平衡：用0.1mol/l 缓冲液将树脂平衡为PH=7.0吸附：在平衡好的树脂中加入蛋清样品，轻微搅拌，搅拌吸附1h 。

洗涤：倒去其余上清，树脂用100ml0.1M 磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤三遍 留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装入2号管中，-20℃保存装柱：将树脂搅拌均匀装入层析柱中，用300mL 含0.05mol/LNaCl 的磷酸盐缓冲液洗涤杂蛋白。

洗脱：用300mL 含0.5mol/LNaCl 的磷酸盐缓冲液以3mL/min 的流速进行洗脱，收集对应最大最高峰的样品，量取体积V 2并记录。

留取0.4ml 上清液，1：1加50%甘油，装入2#管中，-20℃保存沉淀：每100mL 上清液中缓慢加入35克固体硫酸铵，静置30min ，然后用10000rpm/min 转速离心10min ，取沉淀用0.5mol 含0.1mol/L naC 的PBS 缓冲液溶解30-60min ，在用同样转速离心5min ，留取0.05ml 上清液，1：1加50%甘油，装入3#管中，-20℃保存分子筛层析：溶解后硫酸铵沉淀用10000rpm/min 转速离心3min ，用分子筛洗脱，控制流速为15mL 每小时，分部收集洗脱峰。

合并光吸收高峰管。

透析浓缩：将收集到的样品装入透析带中，在含50%甘油的PBS 缓冲液中透析浓缩4小时。

所得样品标号为4#，-20℃保存。

图一阳离子交换树脂洗脱图图二分子筛层析图四．结果分析与思考由阳离子交换树脂洗脱峰观察知只有一个较大的洗脱峰，说明之前一步的除杂蛋白过程进行的是非常好的。

事实上，我们做的也非常认真。

在其他组都赶时间往前做的时候，我们还是保证流速恒定，时间控制在4个小时左右。

但之前由于我的失误，第一次在最大峰出来后没能及时记录，害的全组同学都重头再来了一遍。

好在我们犯错比较早，还有时间补救；同组的同学也都十分宽容，没有抱怨，大家齐心协力，分工明确，第二次也就非常的顺利。

这也教会我团队合作的重要性。

分子筛的洗脱峰也是比较好的。

之前在杂蛋白出峰以后很长时间吸光度值都没有变化，大家都很紧张，担心这就是唯一的峰。

当数据降到很低的时候，大家都有些绝望。

但经过冷静的分析思考，我们觉得既然降到很低，说明它肯定会再次升高，况且王老师说了只要不出现负值都是对的，耐心等待就好，而且我们也仔细回忆了之前的步骤，并没有特别的失误。

所以大家在王老师的安慰下耐心的等等看。

也许是好心有好报，最后终于出峰了！大家都特别的激动。

所以说做实验千万不能急功近利，也不要看别的组都跑完了而自己乱了阵脚。

只要操作规范，一般是不会失误的。

五：注意事项⑴搅拌时一定不能使用磁力搅拌器搅拌，以免将树脂磨碎。

⑵装柱前，先检测层析柱是否洁净，检查是否漏水；将树脂装柱前首先应在柱中加入少量平衡缓冲液。

⑶装柱过程中绝对不可以出现流干现象，流速不得超过3ml/min。

⑷分子筛装柱时，一定要用胶头滴管环壁加入，静置至界面明显后方可洗脱。

⑸加入固体硫酸铵时要缓慢。

⑹过筛前一定要将检测器调0，并且赶走气泡。

⑺制备样品冷冻时不要忘记加等体积的甘油，以防冻裂。

另外解冻后的样品是不能再次冷冻的。

III．活力、蛋白浓度测定一、实验原理棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度值由465变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律，通过测定595nm处的吸光度值的增加量可对蛋白质浓度进行定量测定。

溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶，可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，使细菌溶解。

本实验以溶壁微球菌为底物，通过测量细菌悬液浊度的变化来测定溶菌酶的活性。

二,实验仪器及试剂仪器：722s分光光度计试剂：测活缓冲液；底物溶液Ⅰ；考马斯亮蓝G-250试剂；准蛋白质溶液.试剂配制过程见I.实验准备(原始记录纸)三、实验步骤及流程图四：实验内容及步骤1.蛋白浓度的测定(1)标准曲线的制定取14支试管，按下表分两组进行平行操作。

管号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液/ml 00.010.020.030.040.050.06测活缓冲液 0.100.090.080.07 0.060.050.04考马斯亮蓝G-2505ml摇匀，1h 内以0号试管为空白对照，在595nm 处比色A 595nm0.1820.0.2420.0.5530.0.6780.8230.995绘制标准曲线：以A 595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。