电生理实验常见问题解答（1）『转载』2010-10-09 14:53请问目前分析细胞外放电的信号处理软件较好的是什么？价格昂贵的有国外的PCLAMP系列软件和POWERLAB；价格便宜的较好用的有国产的PCLAB 和MEDLAB。

如果感兴趣输入GOOGLE，一搜即知。

axon guide是很经典的哦，大家可以到公司主页上下载本书主要针对PATCH，是AXON公司的产品配套广告说明书，但是也包含了不少基本电生理知识，集中阅读一下第1、2章节有帮助。

可以下载看看，网站如下，请教：干扰的大小如何检测？检测干扰大小和你记录电信号一样，可以从相关软件读出来，也可以从示波器上读出。

建议丁香妹妹找一些基础电生理书籍熟悉一下，不要着急，先入门为重。

请问微电极的电阻如何测量?怎样才能保证电极尖端已被电极内液完全充满?给予电极一个电流/电压，可以从示波器上读出来，也可以从相应的放大器上显示出来。

建议购买带有芯的玻璃电极，这样可以简单地从尾部灌入内液后，轻轻用手指敲打电极即可；如果是无芯电极，就需要先用注射器将电极尖端充满，而后在从尾部灌入内液。

问题是有时尖端太细,从尾部注入内液后,很难保证尖端全被充满.注射器接皮管——皮管接电极尾部——电极尖端深入电极液中——抽吸注射器——电极尖端充满液体——再从电极尾部管电极内液——解决问题了。

我在记录细胞外放电时,干扰太大,诸如50hz的交流电干扰,请问如何尽可能地排除这些干扰信号?交流电干扰应该不难处理，只需要中间接一个直流电转换器即可。

我想用Patch做平滑肌的BK通道,请教Pleace前辈,在酶解法分离细胞时,使用DMEM会因为含钙高而影响结果吗?文献多数都用无钙液，如果使用前我用PBS洗三次是否可以？你最好用无钙液，即使后来用PBS洗三次也不可以。

因为之前的无钙液操作不仅可以保护细胞，而且可以使之处于低兴奋状态。

屏蔽和接地是电生理基本要求。

如果你记录的信号足够大的话，可以不用屏蔽。

但生物电信号一般都很弱，这就是为什么要屏蔽和接地。

也是为什么很多时候晚上做实验干涉小——因为晚上用大功率电器的人相对少些，空间的电磁干扰相对小些，地线相对也干净一些。

屏蔽笼即法拉第笼，一般是一层铜网，一层铁网。

铜网屏蔽电，铁网屏蔽磁。

屏蔽笼和系统的信号共地。

关于地线，根据你的系统所记录的信号的强弱要求可以不同，信号越弱，要求越高。

一般细胞外记录甚至更粗的记录要求相对不高。

要是做到单通道水平，就不是凑合能解决问题的。

就是这样，电生理的地线也应该和公共地线区分开来。

一般比较正规的电生理实验室的地线应该单独埋设。

地线埋设的要求其实很简单，尽量减小对地电阻。

但实施起来就有很多方法了。

我听说的一个方法是：从实验室下到地的主线用大概10cm的铜缆。

地上要挖个深1.5—1.8m、1.5*1.5m宽的坑。

铜缆用铜铆钉（尽量减少材质造成的电阻差异）焊在一块1.5m*1.5m*4cm的铜板上。

铜板放入坑中。

板上埋2.5kg食盐、2.5kg 木炭。

再将坑添上。

主线到各个信号地分支点用铜棒焊接。

铜棒上钻孔接地线。

仪器电源不直接接到公共电源上，而是通过稳压隔离电源后接到另设的电源上。

仪器电源的地线和系统的信号地分开接地。

信号地接到单独埋设的地线上。

仪器电源的地线也就是三相插头的顶端那个插头很多时候不接。

震动太大：可能原因有防震台防震效果不好，充气不足，或是实验室附近有什么强振动源；记录槽设计是否合理；液体流速是否太快？记录系统是否稳定：微电极放大器电容补偿是否调好，是否需要校正？记录系统干扰和噪声情况如何？细胞状态的问题：状态不好；或是与细胞的放电类型有关，有时电极刺激了某些类型的细胞，细胞产生放电，适应后放电消失。

温度控制！改变温度对场电位的影响非常大（切身体会）。

系统稳定性！微操是否会漂移，试验过程中是否需要锁定微操位置基线调节不应该调holding电压，应该调offset，也就是液接电位；建议你首先计算一下你所用的电极内液的液接电位（clampex中有计算方法），看看到底与0差多少；另外，保证软件和硬件中都没有加holding电压；如果这些都没问题，判断是否硬件问题，每条接口线是否都连接正确并接触良好？判断是否软件设置中的错误，reset全部设置到出厂状态，然后重新设置！对单通道的了解不是很多，仅提供一点参考意见：1、单通和whole-cell主要在于噪音水平的差异。

单通要求较高，噪音水平最好小于1-2pA，这是由于单通的信号非常小，比如Na，也就在1-2pA左右，而K，最大的也不过10pA，如果抗干扰性差的话，信号很容易被噪声掩盖（所以gain要打大些）。

Ca的信号我没有记到过，不过应该也不会大于10pA。

2、操作基本相同。

我用的是Axon200B，外部连线没有改动，但用的是patch(beta=1)，据说在这种模式下，放大器内部的线路连接和whole-cell (beta=1)不同。

protocol的设置，主要有两方面不太相同，一是电极内外液（给药方式不同），二是钳制电位（针对你给的step电压刺激）。

如果是电压门控性离子通道的话，好像inside 和outside的钳制电位方向不一样，而且电流方向也不同，具体的您最好还是查查文献。

3、clampfit 9.0是可以直接分析单通道的，如果是8.0的版本的话，我不太清楚。

学习膜片钳教材推荐（13本）1.王绍, 徐涛. 电生理学方法.2.韩济生主编. 神经科学原理. 第二版. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.3.张均田主编. 现代药理学实验方法. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.4.陈军. 膜片钳实验技术. 北京: 科学出版社, 2001.5.刘振伟. 脑片膜片钳技术及其研究概况.6.张均田主编. 神经药理学研究进展. 北京：人民卫生出版社，2002.7.康华光主编。

膜片钳技术及其应用，科学出版社，20028.Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. New York: Plenum Press. 1983.9.Sherman-Gold R. The Axon Guide. Axon Instruments Inc. 1993.10.Chad J and Wheal H. Molecular Neurobiology: a practical approach. New York: Oxford niversity Press, 1991.11.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.1992.12.Methods in Enzymology. 1992; 20713.Areles Molleman,Patch Clamping : An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. 2002.Wiley Canada.一点小更正：8.Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. New York: Plenum Press. 1983最新为1995年第二版，FTP中有pdf电子书。

11.Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. Massachusetts: Sinauer Associates Inc.1992.最新为2001年第三版。

medicinegiant推荐的很精彩。

我觉得基线不能回零的原因有三个：1，可能是你的电极的银丝该重新镀了，如果你用的电极是镀有Agcl. 2，可能是你的电极夹持器内有了水，里面潮湿，所以导致基线漂移。

3，可能是由于你的地线没有接好或是地线也需要重新镀Agcl了实现高阻封接的注意事项:1.分离细胞时,酶消化应该适度使膜表面洁净;2.浴液必须严格过滤,除去杂志和灰尘污染;3.电极材料宜选用硬质玻璃,使之具有低噪声的性能,其直径尽可能的小而且要经过热抛光;4.涂敷硅酮树脂改善介电特性;5.电极进入液面时,可稍加10cm水柱的正压,封接时应施加20-30cm水柱的负压,在几秒钟内使Rseal上升到数十个G欧;6.正压解除后,每个电极只能使用一次;7.若电极内含有钙离子,应使用HEPES缓冲液;8.使用低渗透(10%)的电极内液比较容易形成高阻封接.电容补偿对微电极放大器的记录的影响可能有这两种情况：一是欠补偿，会导致记录到信号失真或畸变；二是过补偿，会引起微放的自激，使记录系统不稳定。

MEZ－8201我用过。

它的探头上有个cal接头。

将cal与探头的地接头相连。

8201面板上有校正电压选择。

输出校正电压后，可以在显示屏上看到记录的校正电压。

如果补偿正确应该是方波，如果是欠补偿，方波的直角被滤掉；如果是过补偿，则看到的是双向三角波。

这时你调节面板上的电容补偿旋钮，使看到的波形尽量接近方波。

8201的说明书上有详细的说明，可以照着来。

用无钙液的目的就是记录不出钙激活的钾电流，类似于whole-cell potassium记录中Ia 的记法（用全部钾电流减去Id部分），再正常外液钾电流减去无钙液钾电流。

我觉得还是你的电容补偿没有调好。

你可以先在cal与地之间串个大电阻，10M左右，相当于电极电阻大小（8201附件里应该有这么大的电阻，用于校正用）。

这时调节电容补偿。

等这样调好后在测电极阻抗。

因为电极本身除了电阻外还有电容，还要加上电极与浴液之间的电容。

所以你首先要将放大器内部的电容补偿调好后（排除电极电容以及其他杂散电容的影响），再进行测量就比较准确了。

仪器窗口显示的电压是你所记录的电压。

但你现在记录的是细胞外的电压，也就是细胞膜上通道开放引起的膜外的电流变化。

而不是膜内外之间稳定的电势差。

因此记录的电位有波动是正常的。

你可以将看到的电压波动和记录下来的电压比较一下。

看两者之间相差多大。

窗口的电压值应该不会与记录的相差太大。

BK通道电流很大，做单通道电流，电极的拉制，不一定要涂sylgard，入水电阻5Mo左右比较的合适，封接达到10G以上并难做到，而且并不一定要到10G，只要封接稳定，噪声低于1PA，就可以记到单通道电流。

HEKA的Pulse-pulsefit,不太好做单通道分析，建议使用Pclamp9，或 minianalysis功能强大。

胰岛β细胞的patch clamp很难作的，主要是分离单细胞的质量很难保证。

电导、电流-电压图与直方图能用clampfit得出来，但用他不太方便，作图功能不是太强，建议使用sigmaplot灌流装置很简单，用灌流瓶重力灌流就可，灌流瓶通过一般的一次性输液器与培养皿相连，连接管入水的部分用细的硅胶管。