实验四阿司匹林药物的高效液相色谱法测定
[目的要求]
1、了解高效液相色谱法分离有机化合物的基本原理及操作条件；
2、掌握高效液相色谱仪的基本结构及作用；
3、了解HPLC法测定阿司匹林药片中水杨酸的方法。
[基本原理]
高效液相色谱法是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。
液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。
在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论基础，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。
这种柱色谱技术称做高效液相色谱法。
它可用来作液固吸附，液液分配，离子交换和空间排阻色谱（即凝胶渗透色谱）分析，应用非常广泛。
据估计，世界上几百万种化合物中除20%宜用气相色谱(GC) 分离分析外，其余80%的化合物，包括大(高)分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC ( 正相HPLC、反相HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等等) 进行分离分析。
而且高效液相色谱法还具有以下几个突出的特点：
（1）分离效能高由于新型高效微粒固体相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达5000~30000块/m理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱的1000块/m 理论塔板数的柱效；
（2）选择性高由于液相色谱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性，因此高效液相色谱不仅可以分析不同类型的有机化合物及其同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体；
（3）检测灵敏度高高效液相色谱法使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度，紫外检测器灵敏度可达10-9g，荧光检测器灵敏度可达10-12g；
（4）分析速度快由于高压泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱法其分析时间大大缩短。
高效液相色谱仪器系统的主要部件:储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置（色谱工作站）：
(1) 输液系统输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。
流量的范围要宽，既能满足微柱(内径l~2mm)分析，也能满足常规柱(内径4mm)分析，甚至还可满足半制备柱(内径10mm) 的需求。
目前HPLC常用的是双泵头往复式柱塞泵，流速范围一般为0.001-10 ml/min 。
(2) 色谱柱色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。
常用的填料为硅胶，
可用于反相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。
其中最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。
(3) 检测器检测器用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。
要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。
近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。
常用的检测器有紫外检测器( UVD )、示差折光检测器( RID)、电化学检测器( ECD)、荧光检测器等。
阿司匹林（乙酰水杨酸）为常用的解热抗炎药，并被广泛用于防治心脑血管病。
市售的阿司匹林泡腾片的成分主要为乙酰水杨酸，辅料有玉米淀粉、碳酸钙、胶体二氧化硅、糖精钠、香精等。
由于乙酰水杨酸很容易降解为水杨酸，药物中水杨酸含量测定常被用于阿司匹林药物的质量检测。
用液相色谱法可以很好地分离乙酰水杨酸和水杨酸，乙酰水杨酸和水杨酸的含量可以用外标法或标准曲线法进行定量测定。
[仪器与试剂]：
1.戴安高效液相色谱仪
固定相：C18键和多孔硅胶小球，自动进样器，津腾过滤装置，变色龙色谱工作站
2.试剂
双蒸水，甲醇（色谱纯），阿司匹林泡腾片（乙酰水杨酸，成品药），乙酰水杨酸（分析纯），冰醋酸
[操作步骤]
1、仪器的准备工作
A、泵①确保流动相的充足，一般应在所预计的消耗量之上加150ml，以保证仪器正常运行。
②流动相要新鲜，一般情况下一次制得的纯水应在连续的24小时内用完，未用完应弃掉。
B、溶剂管道
仪器开机前，更换流动相后，管路中会有一些气体，而这些气体会对柱、泵及检测器产生不同程度的影响，因此要求开机时每次都要对管路进行脱气。
C、自动进样器
当连续使用中需要更换样品类型或流动相粘度较大时，应每次进样完成后进行洗针。
D、柱温箱
柱温箱应在打开电源且柱连接好后，及时设置为方法要求的温度。
E、检测器
为减少灯能量浪费，检测器应在样品准备好完成后或基本完成时，且仪器系
统按要求流动相及流速平衡至少30分钟以上后再打开，在完成自检20分钟以后方可开始样品的分析。
2、标准溶液的配制
称取乙酰水杨酸标准品0.1g，精确称量，置于10mL量瓶中，加0.6%冰醋酸的甲醇水溶液强烈振摇使溶解，并用0.6%冰醋酸的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。
然后分别取30µL,50µL,100µL, 150µL, 200µL于5mL量瓶中，用0.6%冰醋酸的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，用有机相滤膜(孔径：0.45μm)滤过，将适量的滤液放入样品瓶中待测。
3、阿司匹林溶液的配制
取阿司匹林泡腾片10片，精密称定，充分研细，精密称取细粉适量(约相当于阿司匹林50mg)，置10mL量瓶中，加0.6%冰醋酸的甲醇水溶液强烈振摇使溶解，并用0.6%冰醋酸的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，用有机相滤膜（孔径：0.45μm）滤过，将适量的滤液放入样品瓶中待测。
4、色谱条件的选择
固定相：硅胶-C18
流动相：甲醇/水/冰醋酸=70/30/0.6，流量：0.5mL/min
紫外检测波长：280nm，柱温：30℃
5、样品的测定
自动进样器会精密量取样品滤液1μl，注射到管路系统中，同时开始计时并记录色谱图，色谱工作站会保存并处理所得的色谱数据。
6、实验结束
按操作流程关闭仪器，整理打扫试验台。
[数据处理]
1、根据标准品色谱图的数据，以标准品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘
制标准曲线；
2、根据色谱图的数据，分析样品峰的归属并利用标准曲线法计算相应的百分含
量。
[注意事项]
1、实验步骤应按照戴安液相色谱的具体操作方法进行，不同的色谱仪器在
操作指令上会有所不同；
2、试验所用到流动相必须用微孔滤膜进行过滤，样品进样前同样需要过滤；
3、试验结束后，要充分的冲洗色谱柱。
[思考题]
1、高效液相色谱的基本组成有那几部分？
2、色谱定性、定量分析的方法有哪些？。