2009,Vol.26No.3化学与生物工程Chemistry &Bioengineering58 收稿日期:2008-11-07作者简介:谭婷婷(1981-),女,湖北武汉人,硕士研究生,主要研究方向:分析化学;通讯联系人:潘祖亭,教授。
E 2mail :ed 2isonttt2005@ 。
纳米材料在生物检测中的应用谭婷婷,王光寅,潘祖亭,罗运柏(武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉430072) 摘 要:纳米颗粒是生物医学中研究最多、应用最广的纳米材料,有许多独特的性质。
综述了近年来国际上以纳米颗粒为基础的纳米技术在生物传感器及生物检测中的研究成果和进展,介绍了纳米颗粒的制备方法及其在纳米生物传感器和纳米生物芯片中的应用,结合纳米病原微生物检测介绍了有关免疫传感器检测细菌的研究成果,并对该领域的应用前景进行了展望。
关键词:纳米技术;纳米生物学技术;纳米颗粒;纳米生物传感器;生物检测中图分类号:O 614 TB 383 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2009)03-0058-04 纳米生物技术是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术,是纳米技术的重要组成部分,也是生物医学领域的一个重要发展方向。
纳米颗粒通常大于1nm ,是生物医学领域应用最广的纳米材料,也是目前研究得最多的纳米材料之一。
纳米颗粒是介于微观与宏观之间的一类新的物质层次,具备许多独特的性质[1],如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应、体积效应等。
实现对纳米颗粒的尺寸大小、粒度分布、形状、表面修饰的控制,以及它们在光电化学中的应用,是纳米颗粒研究的关键。
1 纳米颗粒的制备和修饰除了纳米颗粒的特性,其组成成分对于它们的适用性也是非常重要的,如纳米颗粒的组成成分不仅决定了纳米探针与被分析物的兼容性和匹配性,也决定了检测精度。
最常见用来制备纳米颗粒的原材料是金、硅和半导体(如CdSe 、ZnS 、CdS )等。
金对于纳米生物技术来讲是一种活性材料,因为金纳米颗粒能与巯基发生强的共价键合[2],使得胶态金与巯基标记的生物活性分子结合形成探针可用于生物体系的检测。
Frens [3]用柠檬酸三钠还原HAuC 14得到纳米级胶体金颗粒。
研究者进一步优化此方法合成了直径在13nm 左右的纳米金。
纳米金较容易被改良,因为它具有微弱的带电配体的结合层,能保持稳定;改良纳米金的方法现在已经很优化,适合于大范围的粒径及多种表面组分。
借用纳米金表面易被修饰的特性,Mirkin 提出了一种合成金壳银核的核-壳型纳米颗粒的方法,以薄金壳包裹在银纳米粒子表面,形成一种金外包被的颗粒,它易与烷基修饰的寡核苷酸共价结合,从而形成新型的银/金核-壳探针。
该纳米颗粒既保持着银的化学和物理特性,又具有金的稳定性;这种新型纳米探针与纯金体系的探针有完全不同的色度改变,二者可用来检测同一样本中两种不同的目标DNA 。
硅是一种在生物分析中被广泛采用的材料,如生物传感器、生物芯片等。
硅可以通过多种加工技术制备纳米颗粒、透明薄膜以及固体平面材料。
硅纳米颗粒的制备有两种经典的途径,一种是倒转微乳化法,主要是用来合成染料掺杂硅颗粒和超小磁性硅颗粒;另一种是St/3ber 方法,用于制备纯硅颗粒和有机染料掺杂硅颗粒。
所合成硅颗粒的特征可通过尺度、光学或者磁学特性来描述,其粒径可用透射电镜或扫描电镜来确定(一般直径在60～100nm 之间)。
染料掺杂硅颗粒中的染料分子可以是双吡啶钌(RuBpy 2)、若丹明、四甲基右旋糖苷以及荧光素右旋糖苷等,这种硅颗粒的大小和光学特性是决定其用途的最主要因素。
磁性硅颗粒包括Fe 3O 4/SiO 2和Fe 2O 3/SiO 2两种,其直径大约在2～3nm ;采用超导量子干扰装置(Super 2conducting quant um interference device ,SQU ID )分析其粉末形式,发现磁性硅颗粒的特性接近超顺磁性物质,可见磁性硅颗粒的大小和磁学特性将决定其最佳合成条件。
量子点(Quant um dot s,QNs)是一种半导体晶体材料的纳米颗粒,直径在10nm以内,较普通细胞的体积小数千倍,具有吸收波长范围宽和发射波长范围窄的特性,不同材料的量子点还会发出不同的荧光。
用作量子点的材料有硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、砷化铟(InAs)等,近年的研究中硒化镉最受重视。
量子点的合成途径有多种,从传统荧光标记的量子点到用作测量各向异性的拉长“纳米杆”,较经典的是“由下向上”的一步法反应,即同一容器中,无机物的化学转化与纳米结晶过程。
最初使用的量子点小于10nm,比金属及磁性纳米颗粒的表面积更小,其发光效率也低,还容易发生光化学降解和聚集。
CdSe/ZnS是化学合成的无机物,为了增强其胶体稳定性、水溶性和减少非特异性吸附及细胞内聚集,并减少被网状内皮系统的吞噬,常对其进行亲水性处理:一种是用表面活性剂,如二氢硫辛酸、巯基乙酸等处理其表面,或用聚乙二醇PEG修饰包被的聚合物;另一种是在其表面包被蛋白质,如卵白素、生物素、链亲和素等,这样使其表面获得巯基、羧基等活性基团,以结合蛋白质、抗体、肽或核酸[4～6]。
另外,由于CdSe与ZnS以静电结合,表面带负电荷,可结合带中性电荷或阳性电荷的蛋白质及抗体(如Ig G等)[7,8]。
2 纳米生物传感器纳米材料本身就是非常敏感的化学和生物传感器,固定有能选择性结合靶分子的生物探针的纳米传感器称为纳米生物传感器。
纳米生物传感器能和生物芯片等结合,从而使分子检测更加高效、简便,在微生物检测、体液代谢物监测以及组织病变(如肿瘤的早期发现)等方面应用较多。
211 纳米线生物传感器由于纳米颗粒表面易于改良,纳米线实际上可以被任何可能的化学或生物识别分子所修饰。
纳米材料以一种极度敏感、实时和定量的方式将发生在其表面的化学键合事件转换成纳米线的电导率。
掺硼的硅纳米线已经被用来制作高度敏感、实时监测的传感器,用于检测p H值以及p mol・L-1浓度的抗生物素蛋白、Ca2+等生化物质[9],今后还可以发展应用于阵列扫描和在体诊断。
研究能快速、直接地分析小分子物质和蛋白质大分子特异性结合的微型仪器,对于发现和筛选新药分子有实质性的意义。
Wang等[10]报道了一种硅纳米线场效应晶体管(FET)装置,在酪氨酸蛋白激酶(Abl)的介导下,它能高度敏感、免标记地直接检测到A TP以及A TP的小分子阻断剂(Gleevec),因此能成为药物开发的技术平台。
212 病毒纳米生物传感器病毒颗粒实际上就是生物纳米颗粒。
单纯疱疹病毒(HSV)和腺病毒可以触发磁性纳米珠的集合,从而成为临床上检测相关病毒的纳米传感器。
纳米珠由超磁性氧化铁内核包被右旋糖苷组成,再附着作为抗病毒抗体的G蛋白。
在Weissleder小组的实验中,经磁场作用,一个10mL的血清样本中能检测到少至5个的病毒颗粒。
该系统要比酶联免疫吸附实验(EL ISA)敏感,同时也比基于PCR扩增的检测方法有所改进[11]。
但是利用纳米线场效应晶体管,Hayden能直接、实时地从样本中检测到单个流行性感冒病毒A颗粒;而且用两种抗体修饰的纳米线装置能平行检测出相应的流行性感冒病毒和腺病毒,这提示如果这种装置具有大规模区分能力的话,就有可能在单个病毒水平上同时检测到多种不同的病毒侵袭。
213 光学纳米生物传感器表面等离子体共振(SPR)是一种光和金属电子相互作用的光-电子现象,是将光子所携带的能量转移给金属表面的电子。
虽然迫切需要能特异鉴别周围环境中低浓度生物物质的微型化光学传感器,但目前还不存在未经扩增就能鉴定出自然浓度的这种仪器。
借助局部SPR光谱技术,可利用三面体银纳米颗粒制成一种新型的光学传感器,因为这种银颗粒具有显著的光学特性,能大大提高检测的敏感性。
SPR纳米生物传感器为利用简单、轻便、经济的仪器来实现超敏感的生物检测提供了一条有效途径。
结合纳米技术、生物学和光子学,Vo2Dinh等提出了一种激光纳米传感器,用来对单个活细胞中的蛋白或生物标记进行胞内分析。
这种纳米传感器的光纤被拉长至尖端达到纳米级范围,并被生物探针(如抗体或酶底物)修饰;将尖端插入细胞,激光导入光纤后,尖端的消散区激发目标分子与探针结合,光度检测系统采集结合区域的光信号(如荧光)后用于分析。
Vo2Dinh等相继报道了利用这种光学纳米传感器,在单个活MCF27细胞(人乳腺癌细胞株细胞)中检测Caspase29蛋白和细胞色素C蛋白活性的实验。
214 纳米肿瘤生物传感器肿瘤生物传感器由量子点与能够识别肿瘤细胞标志物的特异性靶向分子(如特异性配体、单克隆抗体、核酸探针等)组装而成,通过靶向分子与肿瘤细胞表面标志物分子的结合,利用物理方法来测量传感器中的磁信号、光信号等,可实现肿瘤的定位和显象,有利于肿瘤的早期诊断。
3 纳米技术在生物检测中的典型应用311 纳米生物芯片生物芯片是在很小几何尺度的表面积上,装配一种或集成多种生物活性分子,仅用微量生理或生物采样,即可以同时检测和研究不同生物细胞、生物分子和DNA的特性,以及它们之间的相互作用,获得生命微观活动的规律。
传统的生物芯片有不少局限性,如不能很好地固定DNA、样品的需要量大、荧光标记不可直接读出和敏感度低等。
将纳米技术应用于生物芯片,能极大地改善这些局限性,如可采用自组装的方法来固定、样本需要量少但敏感度大大提高、结合微电子技术后高产而成本低等。
在过去的10年中,DNA序列的检测在遗传学、病理学、刑事学、食品安全等方面越来越普遍和重要,因此向研究者提出更高的要求,需在同一样本中同时进行千百万不同DNA序列的检测,于是DNA微阵列,也称基因芯片应运而生。
但是,目前的DNA微阵列还面临不少困难:如阵列的制作和读出都必须微型化,以满足“芯片上的实验室”的需要;阵列需有高选择性和高灵敏度。
基于荧光标记的检测体系近年来在DNA芯片中的重要作用已经获得认同,并且在基因差异表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域得到了应用,但其寡核苷酸阵列的制作以及后续的杂交检测都有较高的仪器设备要求,荧光标记物也比较昂贵,这是一般实验室条件无法达到的。
因此,建立和发展高效、快速、低成本的DNA序列测定新方法显得尤为重要。
纳米颗粒的DNA阵列技术改善了荧光标记阵列的局限性,是一种可望广泛应用的新的DNA 检测方法。
在任何异源DNA微阵列的检测中,目标DNA链均需要被标记,以便信号的观察。
除了纳米金用于DNA检测和DNA微阵列外,RuBpy2硅颗粒也能用于痕量DNA检测,该实验基于“三文治”机制,能检测p mol・L-1浓度以下的靶序列。
量子点本身就是荧光标记物,与生物大分子共价结合后,也能实现超敏感的生物检测。