衔接子连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接子 （adaptor）进行处理，人工加上粘性末端。衔接 物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核 苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的 酶切位点的回文结构。如：
BamH I 或Sau3A
CCGGATCCGG GGCCTAGGCC
Hpa II Hpa II

+合成起步信号
缬 氨 酸
G
缬 氨 酸 缬 氨 酸 缬 氨 酸
中 心 法 则
（四）基因克隆的特点和技术路线
• 特点：分子水平上操作，细胞水平上表达 • 技术路线： 1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增
① 产生：同聚物加尾法 • 衔接子(adaptor) • 接头(linker) ② 优点：解决平末端连接效率低的缺点 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断 在A和B分别中加入dATP、dTTP和 末端脱氧核苷酸转移酶
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的 粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点（hybrid site） 由一对同尾酶分别 产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C
材料;小鼠.R型球菌(无毒).S型球菌(有毒) 1.将活的R型菌注入小鼠体内,结果:小鼠活 2.将活的S型菌注入小鼠体内,结果;小鼠死 3.将死的S型菌注入小鼠体内,结果;小鼠活 4.将活的R型菌和死的S型菌同时注入小鼠体 内,结果;小鼠死 表明:无毒的R型菌与被杀死的有毒的S型菌 混合后转化为有毒的S型活菌. 这是格里菲思的实验.说明S菌体内有一种" 转化因子"!为了弄清这种"转化因子"是DNA, 多糖,还是蛋白质.艾弗里有做了以下实验; 1.将R型菌与S菌的DNA共同培养,得到活的R 型菌和活的S型菌,注入小鼠体内:小鼠死 2.将R型菌与S型菌的多糖或蛋白质培养,只 能得到活的R型菌,注入小鼠体内;小鼠活 3.将R型菌与S型菌的DNA和DNA水解酶共同培 养.也只得到活的R型菌,注入小鼠体内;小鼠 活 发现;只有完整的S型仅DNA才能使R型菌转化
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点 ：
G GATC A
C CTAG T
限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互补 的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起 来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补末 端之间的碱基配对而形成的环形分子。
2. 聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大片段 Klenow T4噬菌体DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） AMV（禽源性） MMLV（鼠源性）
5‘
5‘
OH
3‘
3‘ 5‘
SmaⅠ
Vector
连接效率低
缺点
没有方向性
② 在平末端加一个黏端接头
Gene
GGGGGG
GGGGGG CCCCCC
Vector
CCCCCC
BamHⅠ
Gene
BamHⅠ EcoRⅠ
Vector
EcoRⅠ
效率高，且有方向性
4. 目的基因与载体的连接
（1）同源粘末端连接 ① 形成：同一种酶 同尾酶 ② 优点：效率高 一种酶，易找到 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 ④ 对策：载体DNA片断的脱磷酸化处理，或者 提高片段的浓度 限制酶鉴定 降低DNA片段的浓度
5’ 3’DNA聚合酶活性
反转录酶还具有RNaseH活性
3. 连接酶
能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（ OH ） 和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的 作用下，形成磷酸二酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口 （gap）。而且被连接的DNA链必须是双链。
连接酶的来源
DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克 隆
• 将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞 内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形 成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分 子的过程。
（二）DNA重组与克隆的应用
1、获得大量DNA拷贝
2、体外生产蛋白质
3、基因治疗
（三）历史
1944 肺炎双球菌转化实验，证实DNA是遗传物质 1953 DNA双螺旋模型 1960’s 遗传密码 中心法则 1970 发现反转录酶，丰富了中心法则 1946- 发现质粒，为重组DNA提供了载体 1968-70 发现限制性内切酶，使DNA克隆成为可能 1972 成功切割DNA，并与载体相连 1973 成功转化宿主细胞，DNA克隆成功
基因克隆技术路线
分
切
接
转
筛
（五） 工具酶
1. 限制性内切核酸酶 定义 内切：在DNA内部切割 限制性：识别特异序列，在特异位点切割 ------GAATTC-----------CTTAAG-----EcoRⅠ酶切位点
分类
Ⅰ Ⅱ
双链DNA
Mg2+
Ⅲ
双链DNA
Mg2+ ATP
DNA底物 双链DNA 辅因子 Mg ATP SAM 识别序列 特异 切割位点 非特定
组织或细胞染色体DNA
限制性内切酶 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 受体菌载体所携带的所
有基因组DNA的集合。
组织或培养细胞
mRNA cDNA
载体
cDNA与载体连接导入大肠杆菌 鉴定cDNA的克隆数与特征组织或细胞RNA
逆转录 cDNA
衔接物连接法
双衔接物：可以实现定向克隆，防止发 生自连，同时对克隆片段的再删除也比 较方便。
DNA接头连接法
（4） 定向克隆（最常用）
① 定义：目的基因的片段定向插入到载体分子中的 方案。 ② 方法：双酶切 ,由平末端改造（双衔接物法） ③ 优点：防止载体自身环化 正向插入 单拷贝插入 连接效率高
（2）宿主细胞
• 原核：大肠杆菌（DH5α、JM系列、HB101、SSD） • 枯草杆菌 • 真核：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞 要求： 1 对重组子的复制和扩增没有严格的限制 2 含酶较少，尤其是不含降解外源DNA的酶 3 在重组子扩增过程中，不对重组DNA进行修饰 4 不会产生重组DNA的体内重组 5 容易导入重组子 6 符合“重组DNA操作规则”的安全标准
Pst 1
3’
Pst 1
EcoR1
5’
EcoR1
5’ Pst 1 HindⅢ
Pst 1
3’
HindⅢ
正向
反向 酶切鉴定DNA片断的插入方向
（2） 平末端连接
① 产生：酶切 补齐法 削平法 ② 优点：无法解决黏末端问题时 ③ 缺点：载体自身环化 双向插入 多拷贝插入 效率低，酶用量高
（3） 接头连接
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割，而MspⅠ可以。
同尾酶（isocaudamer）
Genbank
获得homo Ⅷ因子全长序列
Ⅷ因子引物
大量Ⅷ因子基因 电泳 收集1500bp的片断 获得的是外显子
2. 载体 定义：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的一类DNA分子 条件： 1 复制起点 (ori) 2 多克隆位点：多种限制酶的单一切割位点 3 筛选标志 Amp+ Kan+ Neo+ 4 分子量不宜过大 否则易断裂、转化效率低 5 表达载体还要有P、E、前导序列、加尾信号、 信号肽、核定位序列等
终止密码
色 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 精 氨 酸 丝 氨 酸 丝 氨 酸
C
亮 氨 酸 亮 氨 酸 异亮氨酸 异亮氨酸
A
异亮氨酸
甲硫氨酸
*
苏氨酸
苏氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸
赖 氨 酸
赖 氨 酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷 氨 酸 谷 氨 酸
精 氨 酸
精 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸 甘 氨 酸
载体种类
功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
载 体种类
来源：
质粒载体
噬菌体载体
病毒载体
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对（3－10kb)。
常有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
双酶切
HindⅢ EcoRⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
在获得DNA片段时，通过PCR加入所需位点 EcoRⅠ
HindⅢ
5.重组DNA的转化
（1）定义
转化作用(transformation)： 质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入 细菌的过程。 转染 (transfection)：重组噬菌体或病毒导入宿 主细胞的过程。 转导作用(transduction)：以噬菌体为媒介，将 外源DNA导入细胞的过程。
1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的，粘末端连接，NAD+供 能 2. T4 DNA连接酶： T4噬菌体DNA编码的，粘末端、平末端连接， 已知唯一平末端连接酶，ATP供能