模块二：相关的分离纯化技术 子模块一：原料的预处理技术
复习提问
简述糖酵解的意义？ 1mol葡萄糖彻底氧化生成多少ATP？
新课导入
我们如何从 生物体中提 取出生物活 性大分子？
生物技术下游加工过程的一般 流程和单元操作
一般下游加工过程可分为4个阶段
1) 2) 3) 4) 培养液（发酵液）的预处理和固液分离； 初步纯化（提取）； 高度纯化（精制）； 成品加工。
思考题:
1.为什么要进行发酵液预处理？ 2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂 3.发酵液分离的主要方法. 4.分离和过滤的主要设备有哪些?

3.凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的 分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能 有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。
凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排 斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用， 使胶粒形成较大絮凝团的过程。
絮 凝
定义： 是指在某些高 分子絮凝剂存在下， 基于架桥作用，使 细胞聚集形成粗大 的絮凝团的过程。
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙 烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、 明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
在碱性溶液中带负电荷。
在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。
A. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。
在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、 水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成 沉淀；
在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu++、 Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。
gR
2 2 GRn GDn = = 900 1800
旋转 直径
转速 r/min
2. 过滤
微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。
过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒 与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清， 并且有高的收率。
A. 根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。
二、发酵液的相对纯化
发酵液中的杂质 a. 高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）
在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。
b. 杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，
在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。
单元组成 板 布 板 布 板
操作注意点
尽量使工作时间和辅助时间接近； 降低滤液粘度
（2）真空转鼓过滤机
（3）硅藻土过滤机
ห้องสมุดไป่ตู้
（3）硅藻土过滤机
3. 其他固液分离方法
1）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤
交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特 点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质 表面的固体（滤饼）移走。
B. 常用过滤设备
（1）板框压滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、
酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于 固体含量1-10%的悬浮液的分离。
优点 过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，
对不同过滤特性的发酵液适应性强。
缺点
不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条 件差，非过滤的辅助时间较长。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺， 用于食品和医药工业时应谨慎。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用
医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍 生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有 机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、 脱乙酰壳多糖等）。
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）、高价无机离子的去除方法
1. Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注
意回收草酸） ；
2. Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可 溶性络合物； 3. Fe2+ ——黄血盐，→普鲁士兰沉淀
（二）杂蛋白的去除方法
1. 沉淀法
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。 在酸性溶液中带正电荷；
聚丙烯酰胺絮凝剂
（3）混凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型 高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸 附桥架的双重机理； 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝 聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚 和絮凝机理的过程，称为混凝。
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量 的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过 滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等， 最常用的是硅藻土。 使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等粒度用量为700 g/m3； 粗粒用量为700-1000 g/m3。
④ 液相粘度大，大多为非牛顿型流体；
⑤ 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、 蛋白酶水解等作用的影响。
改善发酵液过滤特性的物理化学方法：
调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添 加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。
1.降低液体粘度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低 液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热 温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。
发酵液
下 游 加 工 过 程 的 一 般 流 程
预处理 —— 产 品 的 收 得 率 和 质 量 控 制 。
提取 精制
（加热、调pH、絮凝）
细胞分离 （过滤、离心分离、膜分离) 细胞破碎 （匀浆、研磨、酶解） 细胞碎片分离 初步纯化
胞 外 产 物
胞 外 产 物
（离心分离、双水相萃取、膜分离）
（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）
2.调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值 可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵 液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的 电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在 某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。
2）双水相萃取
向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后， 形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另 一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。
3）吸附法
向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过 装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选 择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： ① 非离子型、 ② 阴离子型（含有羧基） ③ 阳离子型（含有胺基）
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤 层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体 含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦 芽汁、酒类和饮料等的澄清。
滤饼过滤：
过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤 维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤 渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方 法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用， 适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。
2. 变性法
① 加热， ② 大幅度调节pH值， ③ 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
不足之处
a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物； b. 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱； c. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 ① 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同 作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质； ② 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠， 两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶 性粒子吸附并包裹在其中除去。
去 除 杂 蛋 白
降 低 发 酵 液 粘 度
目的
不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞 碎片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质， 以利于后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
高度纯化 （重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）
成品加工 （浓缩、无菌过滤、干燥、成型）
影响其纯化的因 素是什么？
影响发酵液后处理的主要因素
粘度,杂蛋白 影响树脂对产物的吸附能力； 在萃取操作中，易产生乳化，不利 于两相的分离； 污染滤膜，降低滤速 高价无机离子 当采用离子交换法提取产物时，影响 树脂对生化物质的交换容量