的化学键 有较 强的水解偏好性 。以上结果表 明 ：该 菌株发 酵所产 的蛋 白酶在蛋 白水 解加 工行业 中具有潜 在 的开 发应 用价值 。
关 键 词 ：枯草杆菌 Ｇ 一 ；蛋 白酶 ；发酵优化 ； Ｓ １ 响应 面法 ； 白水解 蛋
中图分 类 号 ：Ｑ ３．７ ９９９
文献标 志码 ：Ａ 文章 编号 ：０２ — ５９ （０２ ４ ０７ — ９ ５９ ６７ ２１）０ — ０９ ０
微生 物 来 源 ，并 表 现 出潜 在 应 用 价 值 ，但 是
Ｍｎ Ｏ （ ． ／ ） Ｓ ０ １ｇ Ｌ 。 １ ２ 发酵粗 酶 液制备 ．
取 ５ｍＬ于 ３ Ｉ培 养 了 ２ ７ｃ ＝ ４ ｈ的种 子 培养 液 接 种 于含 １０ｍＬ发 酵培 养基 的三 角瓶 中。３ ０ ７℃摇 床 培养 ４ ２ ０ ｒｍ ｎ ，将 发 酵 所得 菌 液 ８ ０ ０ｒ ８ｈ（ ０ ／ ｉ） ０ ／ ａ ｒ ｎ离 心 １ ｉ ｉ ０ｍ ｎ获得 发酵 液上 清 ，即为蛋 白酶 的粗 酶液 ，用 于蛋 白酶 活性测 定 。 １ ３ 酶活 力测 定 ．
收 稿 日期 ： ０ ２— ３— ５ ２ １ ０ ０
基金项 目 ：广州市重大科技攻关资助项 目 （０９ １ Ｅ ２ ） ２０ Ａ 一 ０１ ；中央高校基本科研业务费专项基金资助项 目 （０ １Ｚ ） ） ２ １Ｚ Ｉ １ ； Ｘ８ 新世纪优秀人 才计 划资助项 目 （ Ｃ Ｔ一１ —０ ６ ） ＮＥ １ １０ ；中国博士后科学基金 资助项 目 （０ ２ ５ １ １ ） ２ １ Ｍ １８７ 作者简介 ：王方华 （９ ２年生 ） 男 ， １８ ， 博士后 ；通讯作者 ：王永华 ，杨博 ；Ｅｍａ ：ｙｎ ｂ＠ｓｕ． ｄ． Ｎ — ｉ ａｇｏ ｃ ｔｅｕ ａ ｌ
８ ０
中山大学学报 （ 自然科学版 ）
第５ １卷
蛋 白酶 在洗涤 剂 、皮 革制 备 、蛋 白水解加 工 等
行 业 已经 得 到 了广 泛 的应 用 … 。经 过 蛋 白酶 水 解
ｌ 材 料 和方 法
１ １ 菌种 和培 养基 ． 实验 用 菌株 为枯 草芽孢 杆 菌 Ｂ ｃ ｌ ｕ ｔｉ Ｇ ａｉｕ ｓｂｉｓ Ｓ ｌｓ ｌ
摘 要 ：利用 Ｐａ ｅ ｕｍｎ（ Ｂ ｌ ｋｔＢ ｒａ Ｐ ）试验和相应面优化方法对枯草杆菌 Ｇ 一 菌株发酵产蛋白酶的条件进行优 ｃ ｔ Ｓ １
化 ，以期 获得高活性的蛋 白酶发 酵液。同时 ，将 发酵所 产蛋 白酶用 于蛋 白水解 实验 ，以进一 步考察蛋 白酶 的水 解特 性。首先 ，通过 Ｐ Ｂ试验 ，筛选 出 ３个影响菌株发酵过程 中蛋 白酶活力 的主要 因子 （ 化铵 、初始 ｐ 氯 Ｈ值 及 培养 温度 ） 。其次 ，通过 响应面优化法 ，进一步探讨各参数之 间 的相 互关 系并最终 拟合得 出发酵产 酶活 的方程 。
ｐ ｏ ｅ ｓ ｒ ｒ ｆ ｒｔ ｙ ｒ ｌ ｓｓ ｐ ｏ ｅｎｓｆｏ ａ ｉ ｌｓ ｕ ｃ ｈａ ｈａ ｏ ｐ ａ ｔ ｓ ｕ ｃ ． Ｔ ｏｅ ｓ ｒ ｔ ａ ｅ ｍｏ ｅ ｐ ｅｅ ｏ ｈ ｄ ｏｙ ｉ ｒ ｔ ｉ ｍ ｎ ｍａ ｏ ｒ ｅ ｔ ｎ ｔ ｔｆ ｍ ｌｎ ｏ ｒ ｅ ｒ ｒ ｈｅ ｐｒ ｔａ ｅ ｗａ ｒ ｎ ｏ ｈ ｄ ｏｙ ｅ ｃ ｅ ｃ ｌｂ ｎ ｈａ ｏ ｏ ｅ ｙ ａ ｎ ｃｄ ｆＧｌ ｓ ｐ ｏ ｅ ｔ ｙ ｒ ｌｚ ｈ ｍｉａ ｏ ｄ ｔ ｔｃ ｍｐ ｓ ｄ ｂ ｍｉ ｏ ａ ｉｓ ｏ ｕ，Ｖａ ，Ｉｅ，Ｌ ｕ，Ｐ ｅ ｏ ｇ， ｌ ｌ ｅ ｈ ｒＡｒ ａ ａ ｒ ａ ｏ ｅ ｔａ ｒａ ｐ ｉａ ｉｎ ｎ ｐｒ ｔｉ ｙ ｒ ｌｓｓ ｎｄ ｈ ｄ ｇ ｅ ｔｐ ｔｎ ｉ ｌｆ ｐ ｌｃ ｔｏ ｓ ｉ ｏ ｅｎ ｈ ｄ ｏｙ ｉ ． ｏ
多肽能 增加 营养 的高效利 用 ＩＪ ６。因此 ，在食 品加
工 行业 中 ，利 用蛋 白酶水 解 的方法 改善食 品的风 味
ｇＬ ，玉米浆 干粉 （ ５０ｇＬ ，蛋 白胨 （． ／ ／） １． ／ ） １０ｇ
Ｌ ， Ｎ ４ Ｉ （ ． ｇ Ｌ） Ｋ ２ Ｏ （１０ ／ ， ） Ｈ Ｃ ５０ ／ ， ＨＰ ４ ． ｇ Ｌ）
Ｇ ａｇｈｕ５ ０ ４ ， ｈｎ ） ｕ ｎ ｚｏ ６ １ Ｃ ｉａ １
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈ ｓｓｕ ｙ ｗａ ｏ ｄ ｃｅ ｏ ｏ ｔｍｉｅ ｃ ｎ ｉｉｎｓｆｒｃ ｕ ｅ ｐ ｏｅ ｓ ｓａ ｔｖｔ ｒ ｍ ｃｌ ｓ ｂ ｓｒ ｃ ： ｉ ｔ ｄ ｓ ｃ ｎ ｕ ｔｄ ｔ ｐ ｉ ｚ ｏ ｄ ｔｏ ｏ ｒ ｄ ｒ ｔ ａ ｅ ｃ ｉｉｙ ｆｏ Ｂａ ｉ ｌ ｕ—
结果 表明 ，在氯化铵 （． ６ ／ ） 初 始 ｐ （ ． ）以及培养温度 ２ ． ３ ７ ８ｇ Ｌ ， Ｈ ５６ ２４℃ 的条件下 ，发酵液 中蛋 白酶 的最 高酶活 力能 达到 ３ ２ ８４ Ｕ ｍ 。水解试验结果表明 ：相对于植物来源 的蛋 白，该蛋 白酶粗提物对 于动物来 源的蛋 白具 ７ ． １ ／ Ｌ 有较 大的水解偏 好型。该蛋 白酶粗提物对 于 由谷 氨酸 、缬 氨酸 、异 亮氨酸 、亮 氨酸 、苯 丙氨酸或 精氨 酸所组 成
Ｇｕ ｎ ｚ ｏ ０ ４ ａ ｇ ｈ ｕ ５１ ６ ０， Ｃｈ ｎ ｉ ａ；
２．Ｓ ｈ ｏ ｆＢｉ ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｂｉｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ，Ｓ ｕｔ ｉ ａ Ｕｎ ｖ ｒｉｙ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ， ｃ ｏ ｌｏ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｏ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｏ ｈ Ｃｈ ｎ ｉｅ ｓｔ ｆＴｅ ｈ ｏ ｏ ｙ
Ｊ１ ２ １ ｕ． ０２
产蛋 白酶菌株 Ｂ ｃｌ ｕｔｉ Ｇ ａｉｕ ｓｂ ｌ Ｓ一１ ｌ ｓ ｉｓ 发酵 条件优化 及 蛋 白酶水解 应用初 步研究
王方华 亮 ，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ，王永华 ，杨 博
（ ．华 南理 工 大学轻 工与食 品 学 院 ，广 东 广 州 ５０４ ； １ １６ ０ ２ ．华理 工 大 学生物科 学与工程 学院 ，广 东 广 州 ５ ０ ４ ） １６ １
目前 开发 的蛋 白酶 还不 能 满 足 市场 的多 样 化 需求 。
ｔｉ Ｇ ｉｓ Ｓ一１ｂ ｌｃｅｔ ｕｍ ｎ（ Ｂ）ｄ ｓ ｎ ａ ｄｒｓｏ ｓ ｕｆｃ ｔｏ ｏ ｇ ．Ｍｅｎ ｈｌ ，ｐ ｔ ｔ ｌ ｌ ｙＰａｋ ｔ Ｂ ｒ ａ Ｐ — ｅｉ ｎ ｅｐ ｎｅｓｒ ｅｍｅ ｄ ｌ ｇ ａ ｈ ｏ ｙ ａｗ ｉ ｅ ｏ ｎｉ ｅ ａ ａ ｐｉ ｔ ｎ ｆ ｒｔａｅ ｒｔ ｎｈｄｏ ｓ ｅｅａ ｏｄ ｔ ｍ ｎ ｄ ｈｅ ｉｎ ｉａ ｔ ａ ａ ｌ Ｎ ４ Ｉ ｐ ｌ ａ ｏ ｓｏ ｏｅｓｓ ｎｐｏｅ ｙ ｒｌ ｉ ｗ ｒ ｌ ｅｅ ｉｅ ．Ｔ ｒｅｓ ｉｃｎ ｒ ｂｅ ｃｉ ｐ ｉ ｉ ｙｓ ｓ ｒ ｇｆ ｖ ｉ ｓ（ Ｈ Ｃ ，
１ ，低温冻存的菌种首先用 Ｌｒ ．ｅ ａｉ Ｌ ）培 ｕｉ Ｂ ｒ ｎ （ Ｂ ａ ｔ 养 基进行 种 子液 的培 养 。Ｌ Ｂ培养 基组 成 为 ：蛋 白
一
胨 １． ／ ，酵 母 膏 １． ｅ ００ ｇＬ ００ ｇＬ，Ｎ Ｃ ００ ｇＬ ａ １１， ／ ，
ｐ ． 。发 酵 用 培 养 基 组 成 为 ：玉 米 淀 粉 （ ５ ０ Ｈ７０ １ ．
ｉｉａ ｐ ａｕ ｎ ｕｔｒｌｅ ｐ ｒｔｒ）ｎ ｃｓａ ｒｈ ｎ ａ ｃｍ ｎ ｒｔ ｓｓ ｃ ｖ ｙｗ ｒ ｓｌｃ ｎｔ ｌ Ｈ ｖｌｅ ｄｃ ｌ ａ ｍ ｅａｕｅ ｅ ｅｓｒ ｆ ｅ ｈ ｎｅ ｅ ｔ ｆ ｏｅ ｅ ｔ ｉ ｅｅ ｅ ｔ ｉ ａ ｕ ｔ ｙｏ ｔ ｅ ｏ ｐ ａ ａ ｉｔ ｅ—
ｅ ｙ ｕ ｉ ｇ Ｐ ｅ ｉｎ Ｆ ｒｈ ｒ ｒ ．ａ ｍｐｒｃ ｌ ｄ ｌ ｓ ｄ ｖ ｌ ｐ ｄ ｔ ｅ ｃ ｉ ｅｔ ｅ ｒ ｌ ｔ ｎ ｈ ｐ ｅ ｄ ｂ ｓｎ Ｂ ｄ ｓｇ ． ｕ ｔ ｅ ｍｏ ｅ ｎ ｅ ｉ ａ ｉ ｍｏ ｅ ｗａ ｅ ｅｏ ｅ ｏ ｄ ｓ ｒ ｅａ ｉ ｓ ｉ ｓ ｂ — ｂ ｈ ｏ ｔ ｅ ｈ ｓ ｓｅ ａ ａ ｌ ｓ ｗｅ ｎ ｔ ｅ ｅ ｔ ｔｄ ｖ ｒ ｂ ｅ ．Ｍａ ｉ ｍ ｎ ｙ ｔ ｃｉ ｉ ｓ ａｔｉ ｅ ｔ ７ ． ｍＬ，ｗ ｔ ｅ ｉ ｘｍｕ ｅ ｚ ｍａｉ ａ ｔ ｔ ｗａ ｔ ｎ ｄ ａ ２ ８ ４ Ｕ／ ｃ ｖｙ ａ ３ １ ｉ ＮＨ４ ｔ ｈ ａ Ｃ１
３ ７ ８ｇ Ｌ． Ｈ ａ ５ ６ａｄ ｔ ｐ ｒｔｒ ｔ ２ ４ｃ ．Ｒ ｓｌ ｆ ｙ ｒｌ ｉ ｅｐｒ ｅ ｔ ｉｄｃｔ ａ ｔｅ ．６ ／ ｐ ｔ ． ｎ ｍ ｅａ ｅａ ２ ． ＝ ｅｕｔ ｏ ｄｏ ｓ ｘ ｅ ｍ ｎｓ ｎ ｉａ ｄ ｔ ｔｈ ｅ ｕ Ｉ ｓ ｈ ｙｓ ｉ ｅ ｈ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｂ ｃｌ ｓ ｓ ｂｉ ｓＧＳ一１；ｐ ｏｅ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ： ａ ｉ ｕ ｕ ｔ ｉ ｌ ｌ ｒ ｔ ａ ｅ；ｏ ｔ ｚ ｔ ｎ；ｒ ｓ ｏ ｓ ｕ ｆｃ ｔ ｏ ｏｏ ；ｈ ｄ ｏｙ ｉ ｐ ｉ ａｉ ｍｉ ｏ ｅ ｐ ｎ ｅ ｓ ｒａ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｌ ｇ ｙ ｙ ｒ ｌｓｓ
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Ｐｏ ｅ ｉ ｌＡ ｐ ｌｃ ｔｏ ｎ Ｐｒ ｔｉ ｄｒ ｌ ｓｓ ｔ ｎｔａ ｐ ｉａ ｉｎｓｉ ｏ ｅｎ Ｈｙ ｏｙ ｉ
修饰 后 的蛋 白 ，其 自身 的溶 解性 、热稳 定性 以及 在 酸性 条件 下 的抗凝 集 性 均 能得 到有 效 提 高 。 同时 ， 在水 解过 程 中所产生 的多 肽和 自由氨基 酸 ，使得 其
自身 的功 能特性 和营 养价值 也有 所 提高 Ｉ』 ４ 。研 究 表 明 ，低分子 量 的多 肽能 被肠道 直接 吸收 且很 少发 生 过敏 反应 。另外 ，已报 道多种 具有 生物 学功 能 的
第５卷 １
２１ ０ ２年
第 ４期
７月
中山大学学报 （ 自然科学版 ）