收稿日期 2004 04 08基金项目 国家留学归国人员科研基金 获奖项目 2002年国家科技进步二等奖*通讯作者 王喜军:教授,博士生导师,黑龙江中医药大学副校长。
Tel:86 451 82110818,E mail:xijunw @sina com 六味地黄丸的血清药物化学研究王喜军1*,张 宁,孙 晖,孙文军黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨150040摘 要 目的:对六味地黄丸的血清药物化学进行研究。
方法:建立六味地黄丸及口服六味地黄丸后大鼠血清的HPLC 指纹色谱分析方法;分析比较六味地黄丸、缺味处方、单味生药以及各组分给药后所得血清样品,鉴定口服六味地黄丸后大鼠血中移行成分、来源生药及其代谢产物。
结果:口服六味地黄丸后从血中发现了11个入血成分,其中4个为新产生的代谢产物;7个成分为六味地黄丸所含成分的原型,其中有一成分虽为地黄中所含成分的原型,但其它两种药材也能代谢产生,对其体内的量变有共同的贡献。
结论:血中移行成分及代谢产物将成为六味地黄丸的体内直接作用物质,其来源生药为六味地黄丸的主要药物,对其进行深入的研究,将有助于阐明六味地黄丸的有效成分及作用机理。
关键词 六味地黄丸;血清药物化学;代谢产物;指纹图谱中图分类号 R931.71,R917 文献标识码 A 文章编号 1672 3651(2004)04 0219 04中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础,综合应用多种现代技术,分析鉴定口服中药后血清中移行成分,研究其药效相关性,确定中药药效物质基础的应用学科[1]。
应用本方法已经成功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究,首次阐明了该复方的作用机理[2,3];进行了地黄血清药物化学的初步研究[4]。
本实验进行了六味地黄丸的血清药物化学研究。
六味地黄丸出自宋朝钱乙 小儿药证直诀 ,是 滋阴补肾 之首方,现临床上广泛用于多种疾病的治疗。
目前,对六味地黄丸的成分及药效研究较多,但有关的成分研究大多只限于成分的定性、定量的分析,针对药效物质基础的研究很少;有关药效的研究也多只集中在免疫调节作用方面。
六味地黄丸在体内以何种成分、何种形式发挥作用以及作用机理如何,至今少有明确的研究报道。
因此,有必要对六味地黄丸的血中移行成分进行详细的分析,阐明其血中移行成分、代谢产物及方剂的配伍意义,从而有的放矢地改善其生产工艺,提高制备水平,提高临床疗效。
1 实验材料1 1 仪 器Waters 高效液相色谱仪(Waters 600Controller,Waters 600Pump,Waters 996Photodiode Array Detec tor);Water Symmetry Shield C 18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C 18Guard Pak 保护柱;80 2型离心机;H66MC 型超声震荡仪;sk 1型快速混匀器。
1 2 药品和试剂丹皮酚(Paeonol)对照品(中国生物制品药品检定所提供);马钱素(Loganin)对照品(南京中医药大学提供);熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻(均购于哈尔滨市人民药店,经鉴定为正品);乙腈,色谱级(美国迪马(Dikma)试剂公司);其余试剂为分析纯。
1 3 动 物健康Wistar 大鼠,体重为200 20g,6周龄,雌雄不限,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
2 实验方法2 1 六味地黄丸供试品溶液的制备按药典六味地黄丸处方称取药材,采用2000年版药典方法分别制成六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸,各称取1g,用10ml 甲醇超声提取15min(2次),滤过,合并滤液,滤液干燥后加入甲醇定容为10ml,溶液过0 45 m微孔滤膜即得;另精密称取丹皮酚及马钱素对照品1mg,分别置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得丹皮酚及马钱素对照品溶液;上述各样品液供HPLC分析使用。
2 2 空白血清及含药血清样品的制备取Wistar大鼠,禁食12h(自由饮水),按照1 5ml/100g体重,分别灌胃给予蒸馏水、六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸的甲醇提取物的混悬液,给药60min后用1%戊巴妥钠麻醉,经肝门静脉取血5ml,血液在3000r/min条件下离心10min,取上清液1ml,加入0 2ml70%高氯酸,快速摇匀,3000r/min条件下离心10min,取上清液过0 45 m微孔滤膜,备HPLC分析。
2 3 HPLC分析色谱条件Water Symmetry Shield RP18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C18Guard Pak保护柱;柱温30 ;流速为1ml/min;检测波长200~400nm 扫描;流动相乙腈 0 15%磷酸梯度洗脱:0/100 0~60min12/8860~130mi n30/70。
2 4 六味地黄丸及其血清中成分的分析取10批六味地黄丸供试品溶液,以及5批六味地黄丸血清样品在相同的色谱条件下进行HPLC分析,建立HPLC色谱图,并比较分析确定进入血液的成分。
并通过缺味六味地黄丸及单味丸及其血清样品的分析测定,对相应的色谱图进行比较分析,确定入血成分的来源药物。
3 结果与讨论3 1 六味地黄丸给药后血中出现了11个移行成分(图1),与体外样品比较,其中七个为体外成分直接吸收入血,即1、2、4、5、7、10、11号峰为六味地黄丸中所含的原型成分,且1号峰转运入血后的相对含量有较大的提高,而11号峰却明显下降;3、6、8及9号峰为新产生的代谢产物。
Fig1 Comparis on of the H PLC profile of Lui Wei Di Huang Wan and the serum of rats after oral administration of the drug (A) Detected at238nm;(B) Detected at276nma c ontrol serum;b s erum containing drug;c Lui Wei Di Huang Wan经与六味地黄丸、空白血清及单味生药比较分析确定入血成分的来源为:1号峰的归属较为复杂,来源于三种生药。
首先,熟地中含有此成分,此成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相对含量大大提高,表明复方配伍后其有较强的血中转移能力(图2);其次,在除去熟地的样品给药后,血清中仍然出现1号峰,表明其他药材在体内对1号峰的产生也有贡献;山茱萸和泽泻中虽不含有此成分,但给药后血中也能产生该峰(图略),经光谱分析表明与六味地黄丸血清中的1号峰为同一成分,所以推测山茱萸和泽泻中所含的物质被代谢后共同产生该成分。
可见,复方中三种生药对血中同一成分1号峰有共同贡献,表明熟地配伍山茱萸和泽泻的必要性及复方配伍的科学性。
2、4、5、10号峰为山茱萸所含成分直接入血而形成,经与标准物质对照表明5号峰为来源于山茱萸的马钱素;7和11号峰为牡丹皮中所含成分直接入血而形成(图3),经与标准物质对照表明11号峰为来源于牡丹皮中的丹皮酚;3、6、8、9号峰为丹皮酚的代谢产物(图4,图5)。
所以,血清样品中丹皮酚峰较体外样品中明显下降。
丹皮酚被吸收入血后,其代谢产物量较大,具有产生药效的可能性,或许具有更强的生理活性。
从3、6、8、9号峰的保留时间和UV光谱推测可能为丹皮酚的脱甲氧基代谢物、葡萄糖醛酸或胆汁酸的结合体。
Fig2 Comparis on of the H PLC profile of the seru m of rats after oral administration of the Lui Wei Di Huang Wan,radix rehmannia glutinos a and Lui Wei Di Huang Wan without radix rehmannia glutinosa(Detected at238nm)a c ontrol s erum;b serum after admini stration of the Lui Wei DiHuang Wan;c serum after admini stration of the LuiWei DiHuang Wan without radix rehman nia glutinosa;d serum after admi nistrati on of radi x rehmannia gl utinosaFig3 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at238nm)a c ontrol serum;b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;d serum after adminis trati on of cortex moutanFig4 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at276nm)a c ontrol serum;b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;d serum after adminis trati on of cortex moutanFig5 Comparis on of the H PLC profile of Paeonol and the serum of rats after oral administration of Paeonol a c ontrol serum;b s erum af ter adminis tration of Paeonol;c paeonol3 2 本研究初步阐明了六味地黄丸的体内部分化学成分,其结果已能在某种程度上阐明该方配伍机制及药效物质基础。