传统甜面酱中米曲霉的分离与培养条件优化摘要：采用形态学观察对传统甜面酱中分离得到的米曲霉（Aspergillus oryzae）进行了初步鉴定，并对其培养条件进行了优化。
首先，采用单因素试验确定米曲霉在培养时间56 h、湿度90%、曲料温度30 ℃的条件下，霉菌的产酶能力最高；接着采用响应面试验的Box-Behnken设计原理对单因素试验筛选出的显著影响因素进行三因素三水平的分析试验，使用SAS 9.1软件对试验数据进行二次多项式的回归拟合和方差分析，确定其关键影响因素的最终优化值，并且预测蛋白酶和糖化酶的最高酶活。
通过响应面试验可知，当培养时间为54 h、曲料湿度为90%、温度为31 ℃时，米曲霉中蛋白酶和糖化酶的酶活总和为1 764.34 U/g，与优化前相比，酶活提高了17.33%。
关键词：甜面浆；米曲霉（Aspergillus oryzae）；形态学观察；培养条件；响应面试验传统自然发酵酱的风味远比人工保温发酵产品优良，因为变温发酵过程有利于风味物质的形成[1]。
因此对传统甜面酱种曲中的微生物进行分离、纯化和鉴定，筛选优良菌种用于工业化生产，对进一步提高甜面酱质量、改善其风味具有很重要的现实意义。
目前，甜面酱的酿制主要采用沪酿3.042，并且甜面酱中主要功能菌株为米曲霉（Aspergillus oryzae）[2]，所以，研究重点对甜面酱种曲中的米霉菌进行分离鉴定和培养条件的优化，为对其进一步研究打下一定的理论基础。
1 材料与方法1.1 材料酱样品：于江苏省溧阳市收集的民间酱种曲样品。
培养基：菌落分离采用PDA培养基，菌种鉴定采用察氏培养基；霉菌发酵培养基（麸皮培养基）为250 mL三角瓶中加入8 g麸皮、2 g豆粕、10 mL水，于121 ℃灭菌30 min，摇散。
仪器设备：LDZX-50FBS型立式蒸汽压力灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，数码照相机购自北京华旗资讯科技发展有限公司，SPX-300B生化培养箱购自上海跃进医疗器械厂，AIR TECH超净工作台购自苏净集团安泰公司，LHS-150SC 恒温恒湿箱购自上海齐欣科学仪器有限公司。
1.2 方法1.2.1 菌种的分离与纯化在无菌条件下将曲捣碎，称取适量样品，选取适宜的稀释度用生理盐水稀释，采用含100 U/mL青霉素的PDA培养基，采用稀释涂布平板法，每个稀释度接种3个平板，放置于30 ℃的培养箱内培养48 h，进行观察，将菌落形态不同的菌种分离，各自传代培养，至少进行3次传代分离，得到纯化菌种，保存菌种备用。
1.2.2 培养特征的观察对所有分离纯化的菌株划线平板培养后观察培养特征。
1.2.3 霉菌的鉴定湿室培养法[3]：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至载玻片上，用无菌细口滴管吸取少量60 ℃培养基，滴加到载玻片的接种处，在培养基未彻底凝固之前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，轻压。
每皿倒入3 mL 20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全湿润以保持湿度。
将制成的载玻片湿室置于30 ℃恒温霉菌培养箱中培养3～5 d。
用无菌镊子将长有菌体的载玻片取出，放在显微镜下用低倍镜和高倍镜观察[4]。
1.2.4 培养条件的单因素优化试验1）培养时间对产酶的影响。
在温度为30 ℃、曲料湿度为90%及其他培养条件一致的情况下，培养72 h，每隔8 h取样，测定其蛋白酶和糖化酶的酶活，确定菌株的最适培养时间。
2）曲料湿度对产酶的影响。
分别以70%、75%、80%、85%、90%、95%的曲料湿度，于30 ℃培养60 h后，测定其蛋白酶和糖化酶的酶活，确定最适产酶曲料湿度。
3）温度对产酶的影响。
在培养时间为60 h、曲料湿度为90%及其他培养条件一致的情况下，考察温度分别为26、28、30、32、34 ℃时蛋白酶和糖化酶的酶活，确定菌株的最适产酶温度。
1.2.5 响应面试验采用响应面试验的Box-Behnken设计原理对单因素试验筛选出的显著影响因素进行三因素三水平的分析试验[4-8]，以x1（培养时间）、x2（曲料湿度）、x3（温度）3个因素为自变量，由于蛋白酶酶活与糖化酶酶活的变化趋势相近，所以以蛋白酶和糖化酶的总酶活为响应值y，试验因素的水平选取见表1。
使用SAS 9.1软件对试验数据进行二次多项式的回归拟合和方差分析，确定其关键影响因素的最终优化值，并且预测蛋白酶和糖化酶的最高酶活。
1.2.6 验证试验为了确定建立的模型与试验结果是否相符，以优化后的最佳培养条件为菌株的培养条件进行培养，5次重复试验。
2 结果与分析2.1 酱种曲中霉菌的形态学特征对菌落形态和显微镜下分生孢子头的形态进行观察，发现菌落初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗。
分生孢子头疏松放射状，呈黄绿色，孢子梗粗糙无色，初步判断为曲霉科，属于米曲霉（Aspergillus oryzae）（图1）。
2.2 培养条件的单因素优化试验结果2.2.1 培养时间对产酶的影响米曲霉在培养5～9 h时处于孢子发芽期，菌丝开始生长，所以在8 h时蛋白酶酶活几乎为零，糖化酶酶活也很低。
10 h后菌丝开始大量生长，当培养20 h左右，米曲霉开始产生孢子，蛋白酶酶活大幅度上升，糖化酶酶活也上升。
当曲料呈现淡黄色直至嫩黄绿色时，中性蛋白酶分泌最为旺盛[9]。
由图2可知，当培养时间为56 h左右时蛋白酶酶活达到了最大值，糖化酶酶活在培养时间为64 h左右时达到最大值。
当培养时间再延长，由于曲料的含水量比较高且酶活处于下降趋势，曲的酶活会下降得很快且容易染杂菌，导致曲的质量下降不利于后期的发酵。
因此制曲时间宜控制在56 h左右。
2.2.2 曲料湿度对产酶的影响由于米曲霉的代谢作用产生呼吸热和分解热，需要通风降温，在通风时曲料中的水分大量蒸发。
当曲料的湿度在90%以上时，米曲霉才会产孢子。
当制曲湿度偏低时，曲料中的水分大量减少，不利于米曲霉产孢子。
质量好的成曲要求孢子数在60亿个/g（以干基计）。
当湿度过大时，水容易形成水珠造成曲料的水分过大，曲料易染杂菌，且酶活易下降。
由图3可知，当制曲湿度在90%左右时，蛋白酶和糖化酶酶活最高。
2.2.3 温度对产酶的影响霉菌的最适发芽温度为30 ℃左右，生产时一般控制在30～32 ℃。
温度低曲霉发芽慢，制曲的初期阶段曲料的水分大，在温度低的情况下小球菌会大量繁殖。
温度高也不适宜霉菌孢子发芽，却适合细菌增殖；且曲霉的代谢作用产生呼吸热和分解热，热量来不及散发，使曲料的品温过高，易烧曲，酶活下降。
由图4可知，当制曲温度在30 ℃左右时，霉菌的酶活最高。
2.3 响应面试验结果2.3.1 Box-Behnken试验结果根据单因素试验结果，设计三因素三水平的Box-Behnken试验，试验结果见表2。
2.3.2 二次回归拟合及方差分析通过SAS 9.1软件对数据进行分析，并建立二次响应面回归模型，该模型的方差分析结果如表3所示。
以蛋白酶和糖化酶总酶活（y）为响应值，由SAS 9.1软件拟合得到全变量二次回归方程：y1= 1 708+60.125x1-4x2+160.375x3-379.375x12+10x1x2-100.75x1x3-302.125x22-63.5x2 x3-113.875x23。
由表3可知，x3、x12、x22为显著性影响因素，显著性水平P<0.05，模型显著，表明该模型具有显著意义，且不同处理间差异显著[10]；R2为0.936 9，说明响应值（y）的变化有93.69%来源于所选变量，即培养时间、湿度和温度。
因此，回归方程能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳培养条件。
为了进一步研究相关变量之间的相互作用并确定最优点，通过SAS 9.1软件绘制响应面曲线图和等高线图，如图5、图6、图7所示。
等高线图可以较为直观地观察两因素的交互作用，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形则表示两因素交互作用显著。
以上3图中图6的曲线最陡，说明x1和x3的交互作用较显著。
经过软件分析，回归模型存在极大值点。
当培养时间为54 h、曲料湿度为90%、温度为31 ℃时，蛋白酶和糖化酶的酶活总和最大估计值为1 766.63 U/g。
2.3.3 验证试验为了验证模型的准确性，利用优化后的培养条件作为米曲霉菌株的制曲培养条件，重复试验5次，5次试验的总酶活分别为1 823.6、1 745.1、1 720.0、1 752.9和1 780.1 U/g，总酶活平均值为1764.34 U/g。
3 结论由于不同地区的地理环境及气候的差异，空气中微生物菌群的种类以及比例也会有所不同，从而甜面酱种曲中霉菌的种类也有所不同。
本研究筛选出的这株菌株初步鉴定为米曲霉，并通过同现在传统所用米曲霉沪酿3.042比对酶活发现其糖化酶和蛋白酶酶活能力显著优于沪酿 3.042[11]，所以对其培养条件进行了进一步优化。
在单因素试验的基础上，结合资料确定了霉菌固态制曲培养条件的主要因素为培养时间、湿度和温度。
通过响应面分析法研究了这3个主要因素的最佳水平及其相互作用，最终确定最佳培养条件为：培养时间为54 h、湿度为90%、温度为31 ℃，此时蛋白酶和糖化酶的酶活总和最大估计值为1 766.63 U/g。
优化后总酶活为1 764.34 U/g，与优化前相比，酶活提高了17.33%。
目前，生产上酱制品所用到的菌种与酱油的生产用菌种大致相同，但产业化酱制品风味比较淡薄，远不如传统酱制品风味浓郁，因此，研究传统甜面酱种曲菌种，筛选优良菌株，优化发酵条件，并进一步产业化生产，提高质量稳定性，有着非常重要的基础研究意义。
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