银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定
[含量测定]色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。理 论板数按槲皮素峰计算应不低于2500，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离度 应大于1.5。 对照品溶液的制备（略） 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约相 当于总黄酮醇苷19.2mg的粉末，精密称定，精密加入甲醇20ml，称定重量， 超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤 过，精密量取续滤液 10ml，置100ml锥形瓶中，加甲醇10ml、25%盐酸溶 液5ml，摇匀，置水浴中加热回流 30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μ m）滤过，取滤 液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ l，注入液相色谱 仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素和异鼠李素的含量，按下式换算成总 黄酮苷的含量。 总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量）×2.51

薄层扫描法 样品经适宜的溶剂提取得到供试液，经硅胶、聚酰胺或纤维素薄 层 色谱有效分离后，用薄层扫描仪直接进行含量测定。对黄酮类单 体


既可以进行紫外-可见光扫描，又可以进行荧光扫描。 高效液相色谱法 正相色谱(多用于没有羟基或乙酰化黄酮类成分化合物） 固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一 点。 • 反相色谱（C18或C8） 固定相多为十八烷基硅烷键合相 流动相：甲醇-水-乙酸（磷酸缓冲液），乙腈-水 检测器：紫外检测器或荧光检测器

理化性质：易溶于碱水；可溶于热水、甲醇、乙醇、吡啶；微溶于
丙酮、乙酸乙酯；难溶于冷水、苯、乙醚、三氯甲烷。 Mp:177~178℃ ;UV:259,266,299,359nm

常见分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法

中药名称：黄芩 成分：黄芩苷 定性鉴别方法：取本品粉末1g，加乙酸乙酯-甲醇（3：1）的混合
理化特征：溶于甲醇，略溶于乙醇，微溶于水，三氯甲烷或乙醚中不
溶。Mp:187℃（分解）UV:254nm
常用分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法

中药名称：槐花
成分：芦丁

定性鉴别方法：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，密塞，振摇10分
钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每 1ml含4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试 验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙 酸乙酯-甲酸-水（8：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三 氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品 色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
中药名称:葛根 成分: 葛根素
定性鉴别方法：取本品粉末0.8g，加甲醇10ml，放置2小时，滤过，
滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取葛根对 照药材0.8g，同法制成对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇制 成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502） 试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，使 成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取 出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照 药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。

理化性质：易溶于二甲基甲酰胺、吡啶，微溶于热冰乙酸、碳酸氢
钠和氢氧化钠等溶液，难溶于甲醇、乙醇、丙酮，几乎不溶于水、乙 醚、苯、三氯甲烷。Mp:233℃ UV:242,272,310nm

常见分析方法：HPLC,TLCS

中药名称：淫羊藿 成分：淫羊藿苷 定性鉴别方法：取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，温浸30有黄酮类成分，可按要求测定总黄酮含量、黄酮类单
体含量或两者均须测定。含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、 高效液相色谱法等。
（一）、总黄酮含量测定
1.分光光度法一般用于总酮类成分的含量测定。大多数黄酮类化合 物在甲醇溶液中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。 带Ⅰ—出现在300~400nm之间的吸收带 带Ⅱ—出现在240~285nm之间的吸收带 含黄酮类化合物的原料药及部分制剂经必要的提取纯化后，可直接 于最大吸收波长附近测定总黄酮的吸光度，对照品的选定应以最大吸收 波长与总黄酮的相近为原则，单体黄酮和总黄酮均可作为对照品，常以 芦丁等对照品计算总黄酮的含量。 《中国药典》2015版中淫羊藿总黄酮的含量测定（书P156页）
溶液30ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 5ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。另取黄芩对照药材1g，同法 制成对照药材溶液。再取黄芩苷对照品、黄芩素对照品、汉黄芩素对 照品，加甲醇分别制成每1ml含1mg、0.5mg、0.5mg的溶液，作为 对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶 液、对照药材溶液各2μl及上述三种对照品溶液各1μl，分别点于同一 聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）为展开 剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下 检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色 的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显三个相同的暗色斑点。
（2）三氯化铝—醋酸钾比色法
常用芦丁为对照品，采用三氯化铝—醋酸钾为显色剂，显色后在420nm波长处 测定黄酮类成分含量。 (p S:黄酮类化合物与三氯化铝—醋酸钾反应后最大吸收波长并不一定都 在420nm处，因此，最好用所含黄酮作对照品）
消咳喘糖浆中总黄酮含量测定-铝盐配位比色法 见书p157页
（二）、单体黄酮含量测定

理化性质：在60℃溶于二甲基酰胺及甲酰胺。略微溶于甲醇及热冰
醋酸，几乎不溶于水，丙酮、苯及三氯甲烷。而易溶于稀碱及吡啶。 Mp:258~262℃ UV:284nm

常见分析方法：HPLC;TLCS

小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取 2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加15%乙醇5ml使溶 解，加入已处理好的聚酰胺柱（30～60目，1g，内径为1cm，用水湿 法装柱）上，用5%乙醇40ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸去乙醇， 水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干， 残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。另取银杏内酯A对照品、银 杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品及白果内酯对照品，加丙酮制成 每1ml各含银杏内酯A0.5mg、银杏内酯B0.5mg、银杏内酯C0.5mg、 白果内酯1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则 0502）试验，吸取上述两种溶液各5μ1，分别点于同一用4%醋酸钠 溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇（10：5：5： 0.6）为展开剂，在15℃以下展开，取出，晾干，在醋酐蒸气中熏15 分钟，在140～160℃中加热30分钟，置紫外光灯（365nm）下检视。 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑 点。 理化性质：略溶于无水乙醇，易溶于沸乙醇，溶于冰醋酸、碱性水 溶液呈黄色，几乎不溶于水。Mp：314℃（分解） 常见分析方法：HPLC;TLCS;紫外分光光度法
酸碱性 酸性：与酚羟基的数目和位置有关 7,4’- 二羟基> 7或4’- 羟基> 一般酚羟基> 5-羟基 碱性：r-吡喃酮环上的1-位氧原子，可表现出微弱碱性 显色反应 还原反应（盐酸镁粉反应） 与金属盐类试剂的配合反应（铝、铅、锆、镁盐） 硼酸显色反应碱性试剂反应 五氯化锑反应 Gibb’s反应和Emerson反应 光谱特征 I带(300-400nm) →B环桂皮酰基 II带(240-285nm) →A环苯甲酰基
过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。照薄层色 谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液和〔含量测定〕淫羊藿苷项 下的对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫 外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位 置上，显相同的暗红色斑点；喷以三氯化铝试液，再置紫外光灯 （365nm）下检视，显相同的橙红色荧光斑点。
+ 常见的黄酮类成分分析
中药名称 主要黄酮类成分 黄芩 槐米 葛根 陈皮 枳实 山楂 淫羊藿 射干 补骨脂
p158~p159
黄芩苷， 黄芩素，汉黄芩苷，汉黄芩素，千层纸素 芦丁，槲皮素 葛根素，大豆苷 橙皮苷，川陈皮素，新橙皮苷，橘皮素 橙皮苷，川陈皮素，新橙皮苷，5-邻-去甲基川陈皮素 槲皮素，金丝桃苷 淫羊藿苷，淫羊藿次苷，槲皮素 次野鸢尾黄素，野鸢尾苷 补骨脂查尔酮，异补骨脂查尔酮
2 .铝盐配位比色法
本法采用分光光度法测定中药中黄酮类成分，若供试液中其 他组分的吸收存在干扰，可进行比色测定。该法利用黄酮类 成分与铝盐发生配位反应，生成的配合物与背景最大吸收波 长差别较大，可消除背景（即阴性空白）的干扰，显著提高 含量测定的选择性。
（1）硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法
将中药通过适当方法制成供试液 加5%亚硝酸钠反应6min 10%硝酸铝反应6min 4%氢氧化钠反应15min 生成红色配合物后在500nm测定，常用芦丁作为对照品。 （ＰＳ：该法是基于邻二酚羟基的反应，并非黄酮类化合物的专属反应。） 垂盆子颗粒中总黄酮含量测定—铝盐配位比色法 （见书ｐ156页）


色谱法
1.薄层色谱法 硅胶--分离鉴别弱极性黄酮类化合物 • 遵循正相色谱原理，化合物极性越大，所选择的展开剂极性也 相应增大，同时根据化合物酸性强弱调节展开剂的酸碱性。常 用展开剂有苯-甲醇等。 聚酰胺--分离检识含游离酚羟基的黄酮及其苷 • 利用氢键吸附原理，由于聚酰胺和黄酮类化合物上酚羟基形成 氢键缔合，所以作用力较强，需要极性强的展开剂，而在展开 剂中大多含有醇、酸或水，或兼有两者。所以，分离检识游离 黄酮常用有机溶剂作为展开剂，如氯仿- 甲醇等；而分离检识黄 酮苷常用含水有机溶剂作为展开剂，如甲醇- 水等。 纤维素--分离黄酮类多糖苷混合物 • 展开系统：正丁醇-乙酸-水，5%~40%乙酸 展开好的色谱，常在紫外灯（365nm）下观察荧光斑点及其颜 色；亦可喷三氯化铝试剂，在日光灯或紫外灯下观察荧光是否加 强；也可氨熏，是否出现黄色、棕色荧光斑点等。