第五章 分子生物学研究法(上) — —DNA、RNA及蛋白质操作技术
内容提要：
•重组DNA技术回顾 •DNA基本操作技术 •RNA基本操作技术 •SNP的理论与应用 •基因克隆技术 •蛋白质组与蛋白质组学技术
基因操作主要包括： • DNA分子的切割与连接； • 核酸分子杂交； • 凝胶电泳； • 细胞转化； • 核酸序列分析以及基因人工合成； • 定点突变和PCR扩增等。
2003 美国科学家完成狗基因组全序列测定 2004 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定 2005 中、美、日科学家联合完成水稻基因组序
列测定 2005 美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基
因组全序列测定
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产 生具有粘性末端的小片段。
重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂 种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细 菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛 选，获得DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式 从细胞中被分离纯化出来。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
5. 2 DNA操作技术
基因工程： 指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它 载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进 入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持 续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术强调了外源核酸分子在另一种 不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。
5. 1 重组DNA技术回顾
三大成就： ① 在20世纪40年代Avery确定了基因的分细菌转化与目标DNA分子的增殖
细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株 的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 •提供转化DNA的菌株叫作供体菌株； •接受转化DNA的细菌菌株称为受体菌株。 大多数细菌，正常条件下转化效率很低。 为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理 化处理，以增加它们获取DNA的能力。经历了这种 处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。
核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来， 按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已 经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研 究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成 的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却 时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼 脂糖溶液，成球后可得到不同孔径的球 状凝胶，用于分离核苷酸类化合物。
凝胶电泳的基本原理： • 一种分子被放置到电场中，就会以一定的速度移 向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁 移速度，叫做电泳的迁移率。 • 电泳迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的 净电荷数成正比，与片段大小成反比。 • 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状 态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子，在 电场中向正极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量 的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此都能以同 样的速度向正电极方向迁移。
EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），分子式： C21H20BrN3，熔点：260 - 262°C ，是一种高度灵敏 的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中 的DNA。 溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙 红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶 成像处理系统拍摄。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是 强诱变剂,具有高致癌性! EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。
1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发， 挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB溶液的处理方法 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入 等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放 置1小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废EB接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。
•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 •聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱 基对之间。 •凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小， 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色， 然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地 检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每 条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可以 被清晰地检测出来。
双酶切
在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求， 只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子 上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载 体（vector）。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子 量复制子都可以作为基因导入的载体。
DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问 题； ② 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交 替问题； ③ 50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操 纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
重组DNA技术史上的主要事件
（GMO转基因生物）