液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定癫痫患者血清中卡马西平的浓度谢 华Ì，王 荣，贾正平∗， 徐丽婷（兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050）摘要目的：本文建立了液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定患者血清中的卡马西平浓度的方法。
方法：色谱柱：Zorbax Extend-C18柱（150×4.6 mm I.D，5μm）；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1。
结果：卡马西平浓度在2～40 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为101.1%，日内精密度、日间精密度的RSD分别为3.39%和4.11%。
并测定了10名患者血清中卡马西平的浓度。
结论：本方法具有良好的灵敏度、准确度、精确度及专属性，结果准确，重现性好，易于操作，可用于患者血清中卡马西平浓度的测定。
关键词卡马西平；LC/MS/MS；血清Content Determination of Carbamazepine in epileptic patient serum by Liquid Chromatographic Tandem Mass SpectrometryXIE Hua, JIA Zheng-ping*, WANG Rong, XU Li-ting (Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China)ABSTRACT OBJECTIVE:An analytical method based on Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detection was developed for the content determination of carbamazepine in epileptic patient serum. METHODS: The method included that the column was Zorbax Extend-C18(150×4.6 mm I.D.，5μm ); mobile phase was methanol-0.01mmol·L-1amine acetic acid (80:20，v/v) at a flow rate of 0.3 mL·min-1. RESULTS: The method was proved to be linear in the range of 2~40ng·mL-1 with a regression confficient of 0.9976. The average recovery rate was 101.1%(n=5). The RSD of average contents of intra-day and inter-day was 3.39% and 4.11% respectively. The carbamazepine concentrations of ten epileptic patient’s serums were detected. CONCLUSION: This method is accurate, precise, sensitive and specific to be used in the content determination of carbamazepine serum.KEY WORDS Carbamazepine; LC/MS/MS; Serum∗基金项目：国家科技部重大项目（2008ZXJ09014-010）Ì主管药师。
研究方向：临床治疗药物监测。
电话：(0931)8994675; E-mial: xiehua-72@Ä通讯作者：教授，主任药师，博士。
研究方向：临床药学。
电话：(0931)8994652。
卡马西平是临床常用于治疗癫痫、三叉神经痛及心率失常治疗药物。
癫痫是一种以中枢神经系统功能失常为主要表现的常见综合症，患者需长期服药才能控制病情，有的则要终生用药，临床上用于治疗精神运动性癫痫疗效好；同时它具有膜稳定作用, 临床上也广泛用于三叉神经痛的治疗。
但因其治疗窗窄，药物的治疗血药浓度及半衰期的个体差异大，长期用药会产生不良反应，加之其自身诱导代谢和其他药物诱导的代谢，都能使卡马西平的血药浓度和药物动力学过程发生较大改变，而且很难获得最佳疗效，若剂量和用法不当可导致疗效不佳或出现严重毒副反应。
上市剂型主要为片剂，现已作为预防、治疗癫痫的一线药物。
因此，为了提高用要的安全性和有效性，需进行治疗药物监测。
文献报道[1-6]多用HPLC法进行血清中抗癫痫药物的血药浓度测定，临床主要以荧光偏振免疫（FPIA）进行监测[7-8]，分离时间长，同时因费用高，患者难以承受。
但目前未见文献报道运用液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）测定患者血清中卡马西平方法，本文建立了测定癫痫患者血清中的卡马西平浓度的LC/MS/MS方法，为血药浓度监测和体内卡马西平研究提供更为准确和便捷的方法。
1仪器与试药API 3200 型四极杆串联质谱仪，配有离子喷雾离子化源以及Analyst 1.4.2 数据处理软件（美国Applied Biosystem公司）；岛津超高速液相（UFLC）色谱系统，包括LC-20AD 二元输液泵，DGU-20A3混合器，SIL-20A自动进样器，CBM-20A 控制器（日本岛津）。
卡马西平对照品（中国药品生物制品检定所，批号： 0142-9503）。
甲醇，乙腈为默克公司色谱纯，其它试剂均为分析纯。
血样来源于兰州军区兰州总医院门诊和住院患者，均获得知情同意。
2方法与结果2.1 样品的处理2.1.1 卡马西平对照品精密称取卡马西平对照品0.5mg（中国药品生物制品检定所，批号：0142－9503），置于5ml的容量瓶中甲醇至刻度作为贮备液。
2.1.2血样处理取血清100μL于0.5ml离心管中，加入200μL甲醇，混匀，涡旋1min，10000 r·min-1离心5min，取上清液，60℃水浴中氮气吹干，用甲醇200uL溶解混匀，涡旋1min，10000 r·min-1离心5min，取上清液并进样。
2.2 分析方法2.2.1色谱条件色谱柱：Zorbax Extend-C18 柱，5 μm 粒径，150×4.6 mm I.D.，美国Agilent公司；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：室温；进样量：10 μL。
2.2.2质谱条件离子源：电喷雾离子化源(ESI)；离子喷射电压：4800 V；温度：600°C；源内气体1（GS1，N2）压力：70 psi；气体2（GS2，N2）压力：60 psi.；空气压缩机压力：0.4MPa；正离子方式检测；扫描方式为正离子监测；DP 电压：70 V；EP 电压：10 V； CXP 电压：3.2 V；碰撞气（N2）压力：3 psi；卡马西平的碰撞诱导解离（CID）电压为30V；用于定量分析的离子反应分别为m/z 237.2→m/z194.2。
2.3分析方法确证2.3.1 质谱分析将卡马西平标准品溶于流动相中，按“质谱条件”项操作，相应的二级全扫描质谱图见图1。
图1卡马西平[M+H]+的二级全扫描质谱图Fig 1 MS2 full scan mass spectrograms of carbamazepine2.3.2 方法的专属性取流动相1.0 mL，进样10 μL作空白图谱，得色谱图2 a；取一定浓度的卡马西平对照品溶液1.0 mL，进样10 μL作对照图谱，得色谱图2 b，卡马西平的保留时间分别为2.97 min；取卡马西平血清提取物供试样品，进样10 μL作样品图谱，得色谱图2 c。
结果表明，空白中的内源性物质不干扰卡马西平的测定。
图2 LC/MS/MS测定卡马西平的典型色谱图Fig 2 Typical chromatograms of Carbamazepinea 空白样品(blank ) b卡马西平对照品(control) c 空白血清+卡马西平对照品 d 患者血清中卡马西平(sample)2.3.3 基质效应以卡马西平为研究对象，在空白全血中加入卡马西平标准溶液，使得成为含卡马西平为12ng/ml的溶液来考察基质效应对测定卡马西平影响。
按“2.1.2”项下处理后进行LC-MS/MS分析，得峰面积A，保留时间为2.97 min；同样对12ng/ml卡马西平标准溶液进行分析，得到相应的峰面积B，保留时间为3.01min；以A/B接近1的方法考察其基质效应，结果表明本方法无基质效应。
2.3.4标准曲线的制备取空白血样1.0 mL，加入对照品贮备溶液，按“血样处理”项下操作，依次配置浓度为2.0, 4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，16.0，20.0和40ng·mL-1，制备标准曲线。
以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，进行回归运算，求得的直线回归方程，即得标准曲线: y=212x+2.12×105 (r=0.9974)。
线性范围为2.0～40ng·mL-1，定量下限为2ng·mL-1(S/N=10)。
2.3.5 精密度按“标准曲线的制备”项下操作, 制备卡马西平低、中、高三个浓度（分别为2.0,8.0，20.0n g·mL-1）的质量控制（QC）样品，每一浓度进行5 次分析，连续测定三天，根据当日的标准曲线，计算QC 样品的测得浓度，根据QC 样品结果计算本法的准确度与精密度，结果见表1。
表1 LC/MS/MS测定卡马西平含量的日间精密度与日内精密度（n=5）Tab l The intra-day and intre-day precision of Tacrolimus in capsules浓度ng·mL-1日内精密度(n=5)Intra-day precision日间精密度(n=5)Intre-day precision2.0 1.99±0.803.25% 1.94±0.984.18%8.0 7.98±0.62 2.02% 8.01±1.43 3.04%20.0 19.76±2.58 4.89% 20.01±2.79 5.10%3.39%4.11%2.3.6 回收率取空白1.0 mL，按“血样处理”项下操作，加入标准品贮备液制备低、中、高三个浓度（卡马西平分别为2.0, 8.0, 20.0 ng·mL-1）的样品，每一浓度测定5次。