w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 中国人类遗传资源疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程Technical Specification for the Paraffin Imbedding Tissue Collection and Trimming and Preservationof Chinese Disease Genetic Resources（讨论稿）中国人类遗传资源平台项目组2005年9月w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 前 言石蜡有适当硬度，包埋组织能够常规制备成36微米厚度的切片用于诊断和研究。

由于石蜡包埋组织能够较长时间地保存组织内的蛋白质和核酸，用石蜡包埋固定好的人类疾病组织制作成切片，可用于HE染色分析（通过镜下观察，做出临床病理诊断）、DNA 及RNA的原位杂交分析、蛋白质分析、核酸提取用于病原微生物的诊断或其它分子生物学诊断及研究等。

故规范性地作好石蜡包埋组织、提供适宜的蜡块储存环境、严格培训蜡块保管人员，以及明确蜡块管理使用程序非常重要。

目前，我国尚无关于人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。

w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn 目 次前 言 (II)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 (2)4.1 取材 (2)4.2 洗涤 (2)4.3 脱水 (2)4.4 透明 (3)4.5 浸蜡 (4)5 组织包埋 (5)6 切片、展片及烤片 (6)7 染色 (7)8 封片 (8)9.1 蜡块存放环境 (8)9.2 蜡块存放温度 (8)10 保管人员的资格及要求 (9)11 蜡块使用的范围 (9)12 蜡块的医疗安全规范 (9)参 考 文 献 (11)w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程1 范围本规程适用于与人体疾病石蜡包埋组织标本相关的诊断、医学及司法鉴定、科研操作，因此在医院、司法机关和科研单位应规范执行。

2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。

GB/T 1.1-2000 标准的结构和编写规则GB 19489-2004 生物安全通用要求ISO 15189 医学实验室质量和能力的专用要求ICD-10 WHO国际疾病分类编码CNAL AC23-2003 医学实验室认可准则《人类疾病固定组织的收集整理保存技术规程》《人类遗传资源管理办法》《赫尔辛基宣言》3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

3.1 人类疾病石蜡包埋组织资源是指可经过石蜡包埋保存的人体各种疾病组织材料及相关信息资料。

3.2 标本为了进行疾病的临床诊断、治疗及相关的研究工作，所切取或采集的人体各组织器官的样本。

w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn3.3 固定人体组织固定是采用适宜的固定液充分地固定组织，以便将组织细胞的固有形态结构保存下来，满足疾病诊断和相关研究的需要。

固定液除了可以固定组织之外，还具有硬化组织细胞的作用。

4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡人体新鲜组织的固定要根据后期不同的用途选用不同的固定剂，常规选用4%中性甲醛液（用缓冲液配制），经病理医师取材和标记后，将组织依次进行冲洗、脱水(用递升浓度的乙醇等)、透明(用二甲苯等)和浸蜡(用石蜡)处理，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片和染色，制成切片。

4.1 取材由具有一定经验的病理医师进行组织标本的取材。

该医师应熟悉正常和异常组织大体结构，必须切取到病变组织、正常组织及二者交界组织，大小各为 2cm×1.5cm×0.3cm，同时完成相关的记录，如病理号、取材部位、组织大小和大体描写等。

4.2 洗涤洗涤的目的是把渗入组织中的固定液洗去，以利于脱水及透明，并防止染色过程中福尔马林色素的产生。

经常规固定液固定的组织须流水冲洗约30分钟，具体时间依固定时间长短而稍有不同。

4.3 脱水脱水的目的是去除组织内固有的水分和组织经过固定及洗涤后含有的大量水分，以利于透明剂和石蜡渗入组织。

可使用脱水剂逐步将组织块内的水分置换出来。

脱水剂必须是易溶于水的有机溶剂，常规使用的有乙醇、丙酮等。

由于脱水剂穿透组织的速度很快，常导致组织过度收缩及变脆，因此必须采用梯度脱水的处理方法，从低浓度开始，依次递增，直至纯脱水剂，最终组织内部的水分将被高浓度脱水剂所取代。

目前，脱水过程已全部实现了自动化，各公司生产的脱水机型号和基本原理一样，具体操作方法及条件设定请参照脱水机使用说明。

整个脱水过程在常温下进行：w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cna) 乙醇－甲醛（AF）液固定：60～120 分钟；b) 80%乙醇：60～120分钟；c) 95%乙醇I：60～120分钟；d) 95%乙醇II：60～120分钟；e) 无水乙醇I：30～60分钟；f) 无水乙醇II：30～60分钟；g) 无水乙醇III：30～60分钟；4.3.1 注意事项a) 未经充分固定的组织不得进入脱水程序，用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上；b) 组织脱水必须由低浓度向高浓度逐步过渡，若组织含水量过多(如胚胎组织)，则脱水剂浓度应由更低级(如30%～40%乙醇)开始；c) 组织脱水要彻底干净，只有把水分脱去，才能使组织块在二甲苯中透明，石蜡才能渗透到脂肪细胞和组织中去，若脱水不彻底，则切片后组织与空气接触即干燥收缩，蜡块切面组织会出现凹陷现象。

即使勉强切片，染色效果也很差，且组织于染色时易脱落。

因此脱水彻底与否是制片质量好坏的一个重要环节；d) 脱水时间要适当，若时间太短则脱水不彻底；时间过长则会促使组织收缩变硬。

脱水时间要根据组织块大小、厚度、脱水剂的新旧程度等适当增减调节；e) 脱水必须在有盖瓶子内进行。

因高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天空气中湿度较大也会影响乙醇的浓度；f) 必须保持无水乙醇的绝对无水。

纯乙醇中如含有水分，可加入无水硫酸铜吸收水分。

无水硫酸铜遇水变成蓝色，用后的无水硫酸铜，经高温干燥后，仍可重复使用。

另一方法是采用磺酸钾型阳离子交换树脂吸收水分。

把吸满了水的树脂，加温到150℃左右变成干燥的树脂，也可重复使用。

4.4 透明乙醇等脱水剂不能溶解石蜡，所以在浸蜡之前需要一个既能与乙醇混合又能溶解石蜡的媒剂，称为透明剂，以便使石蜡渗入到组织中去。

当组织中全部为透w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。

如果组织不能透明，表明脱水不彻底，必须重新脱水补救，否则将影响到浸蜡的进行，但重新脱水后的效果往往不好。

4.4.1 透明效果判定肉眼观察组织块呈半透明或透明状态即可。

4.4.2 透明剂常用的透明剂有二甲苯(xylene)、甲苯(toluene)、苯(benzene)、氯仿(chloroform)和TO型生物制片透明剂等，各类透明剂各有其优缺点。

对于人体组织宜使用二甲苯进行透明：a)二甲苯I：20 分钟；b)二甲苯II：20 分钟；c)二甲苯III：20 分钟。

4.4.2.1 注意事项:a) 二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；b) 组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长,以防组织变硬、变脆，具体时间依不同类组织类型和大小而定，一般组织块呈现棕黄色或暗红色透明即可；c) 二甲苯应及时过滤、更换；d) 组织块经二甲苯处理后不显现透明时，常提示该组织固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。

4.5 浸蜡组织经过透明后，移入溶化的石蜡溶液内，这一步骤称浸蜡(infiltration)，其目的是以石蜡置换出组织块中的二甲苯，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切成薄片。

浸蜡的方法是将组织块经过二甲苯透明后，立即投入到溶化的石蜡中去。

在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡处理(石蜡I、II、III)，使剩余透明剂完全除尽，否则将影响切片质量。

根据熔点的不同，石蜡分为软蜡和硬蜡。

软蜡熔点低，硬蜡熔点高。

一般切片所用的软蜡熔点为42～45℃或45～50℃，硬蜡熔点为52～54℃或56～60℃，现在也有62—64℃的硬蜡，适用于南w w w .e ge n e.o rg.cnw w w .e ge n e.o rg.cn方夏天或较坚硬的组织。

组织较硬时，用硬蜡，反之，用软蜡。

浸蜡在温箱中进行，箱内温度略高于石蜡熔点2～3℃即可。

若箱内温度偏低，石蜡会凝固，则达不到浸蜡目的。

温度过高，浸蜡的组织会出现收缩变硬，同时组织中的抗原易受到破坏，不利于免疫组织化学等蛋白质分析。

在更换蜡杯时，要有一定的间隔时间，尽量减少组织内含有的二甲苯被带入最后的纯石蜡杯中，而影响浸蜡程度。

人体组织的浸蜡操作宜采用以下步骤：a)石蜡 I（45～50℃）：60分钟；b)石蜡 II（56～58℃）：60分钟；c)石蜡 III（56～58℃）：60分钟。

4.5.1 注意事项a) 熔化的石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70℃）进行，不得用明火加温；b) 熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；c) 组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔化的蜡中；d) 浸蜡时间要适当。

时间过短，浸蜡不充分，组织将过软；过长时间则组织变硬、变脆；e) 熔蜡应定期过滤、更换。

5 组织包埋包埋(embedding)是组织经过固定、脱水、透明、浸蜡后，再用石蜡铸成蜡块的过程。

包埋用的石蜡熔点要和浸蜡用的石蜡熔点相一致；包埋用的石蜡温度要稍高于浸蜡的温度。

先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲的钝头镊子轻轻夹取已经浸过蜡的组织块，使组织块的最大面或特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中。

要将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。

一般切面方向朝下放置；管状、囊壁、皮肤及层次清楚的黏膜应立埋；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近；包埋时应使组织急速均匀地凝固，以免石蜡产生白色结晶导致切片破碎。