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利用lentiviral vectors 介导的转基因
（ EMBO reports VOL 5 | NO 1 | 2004l i terature report 29 ）
2007年1月，与南 方模式生物中心合 作的实验结果： 转基因小鼠55%阳 性、80%表达。
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2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两 名美国科学家安德鲁·菲尔和克雷 格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰 现象。
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基因沉默的分子机制模型
Long dsRNA
dsRNA
PTGS TGS
mRNA cleavage Chromatin modification
RISC
Translation arrest
81202043 miR-320通过调控Mcl-1对宫颈癌细胞凋亡的作用和机制研究 81201935 miR-532-5p调控RUNX3表达介导胃癌发生发展的分子机制
2
A基因通过调控B信号通路影响C疾病的D功能
1.相关性研究: A--C
组织水平：肿瘤组织样本基因的表达情况 临床水平：基因表达水平与各种临床特点（恶性程度，转移与否，耐药性， 生存率等）的相关性
2. 功能研究: A--D
细胞水平：生长，凋亡，转移，侵润，血管新生，耐药 动物水平：成瘤，转移，药物敏感
3. 机制研究: A--B
分子水平：相互结合，表达调控，翻译后修饰前，降解调控，剪切调控，胞 内定位，激酶信号传导等
目录
3
肿瘤基因功能研究流程推进
肿瘤
第一步：由特定肿瘤找出相关基因 表达检测
基因
目录
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肿瘤功能基因研究技术
传统研究功能基因是把基因转入细胞看功能表型 1、细胞内高表达该基因时，外源表达的基因超过了细 胞内所需的量而体现不出功能。 2、外源高表达基因对细胞也是个刺激压力，会产生假 阳性和假阴性。
当RNA干扰技术出现后，给科研工作者提供了一个很好研究 内源基因的工具。
常规方法：全基因表达谱芯片，蛋白质芯片，质谱检测 目的：通过筛选，找出在肿瘤组织中有表达，和肿瘤的 临床特征有相关性的基因
功能
意义：研究的应用性以及临床相关性
机制
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肿瘤基因功能研究流程推进
肿瘤
第二步：确定候选基因的生物学功能 基本逻辑：改变基因状态后检测细胞模型、动物模型 的表型变化
RNA介导的基因沉默
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RNAi中使用的siRNA
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稳定细胞株
hepG2单克隆细胞株
L02单克隆细胞株
SMMC 7721单克隆细胞株
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吉凯基因慢病毒直接动物实验
吉凯基因提供的慢病毒在生产过程中经过 特殊纯化处理，病毒滴度高，并且病毒毒 性小，可直接用于动物实验。
结肠癌干细胞靶基因Msi-2调控Wnt/β-catenin通路参与结肠癌发生 上海交通大学 发展的机制研究 去泛素化酶USP14调控细胞周期相关蛋白在原发性肝细胞癌增殖中的 中国人民解放军第 机制和功能研究 二军医大学 Klf4调控FoxM1在胃癌发病中的作用 PTPRO通过抑制JAK2/STAT3通路阻止肝癌发生的机制研究 同济大学 南京医科大学
YWHAE过表达活化Rac1信号诱导结肠癌细胞EMT促侵袭转移的机制研究 海南医学院 Nlk经由Wnt通路调控EMT影响结直肠癌肝转移的分子机制研究 EIF3H调控致癌蛋白的积累促进肝癌的发生发展研究 中国人民解放军第 二军医大学 中国人民解放军第 二军医大学
2
2012年获得资助国自然基金列表选取3
Figure 1. Microarray Analysis Identified Twist to Be Upregulated during the Metastatic Prog
Figure 2. Suppression of Twist Expression by Stable siRNA Does Not Affect the Proliferation of 4T1 Cells In Vitro and In Vivo
功能基因研究策略及工具
上海吉凯基因公司 2012年11月 谭畅 tanchang@
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功能基因研究流程
提出问题
基因
功能
机制
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2012年获得资助国自然基金列表选取1
项目批准号 81272249 81201532 81201542 81220108021 81201555 81272241 81201528 81272203 81272235 项目名称 依托单位 批准金 额 65 23 23 280 23 70 23 70 75 内质网应激条件下CHOP直接调节p53基因的转录来抑制结肠肿瘤生长 复旦大学 的机制研究 miR-124对丙酮酸激酶选择性表达的精密调节机制在结肠癌中的作用 复旦大学 应激蛋白Gadd45g调控Stat3活化和诱导肝癌细胞衰老的研究 上海交通大学
标书 网站
表达芯片获得下游变化基因列表
机制
文章示例
Cell, Vol. 117, 927–939, June 25, 2004 Twist, a Master Regulator of Morphogenesis, Plays an Essential Role in Tumor Metastasis
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2006年的诺贝尔生理学奖获得者：
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
25
Nature 1998 391:806-811
原位杂交法检测胚胎中mex-3 mRNA A:杂交液不含探针； B:未注射入ASO或siRNA： C:注射反义RNA； D:注射dsRNA
目录 网站
该文章关键节点：
1.Figure1：由芯片结果找出功能基因twist 2.Figure6：找出受调控的下游相关基因及功能验证 How？ Lucky？？ Or Something important but not show？
目录 网站
基因芯片
全基因表达谱芯片
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From网站
利用lentiviral vectors 介导的转基因动物
Michalkiewicz M, Michalkiewicz T, Geurts AM, Roman RJ, Slocum GR, Singer O, Weihrauch D, Greene AS, Kaldunski M, Verma IM, Jacob HJ, Cowley AW Jr. Efficient transgenic rat production by a lentiviral vector. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007 293(1):881-94.
功能
意义：决定了文章的深入程度 下游分子检测
机制
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不同阶段研究者推进过程解决方案
肿瘤
芯片技术
已确定肿瘤研究方向，手头有组织样 本，但未确定目的基因的研究者
基因
细胞模型 动物模型 OE/RNAi 功能检测
确定单个目的基因
表达芯片获得候 选基因列表
！
高通量筛选
功能
芯片技术等
已找到基因功能
项目批准号 81200257 81200281 项目名称 依托单位 批准金 额 23 23 23 70 23 70 23 23
胆道闭锁中miRNA-155通过SOCS1调控IFN-γ介导的免疫炎症及 复旦大学 其机制研究 MiR-193a-3p调控结肠上皮PepT1表达在溃疡性结肠炎发病机制 上海交通大学 中的作用 上海交通大学
Figure 5. Twist Induces an EMT and Cell Migration
Figure 6. Expression of Twist Results in Repression of E-Cadherin Transcription
Figure 7. Expression of Twist in Human Tumor Cell Lines and in Human Breast Carcinomas
Lentivirus 用于肿瘤基因功能研究
肿瘤研究中
慢病毒感染 肿瘤细胞
慢病毒感染后的 肿瘤细胞注射入 动物体内成瘤
慢病毒 瘤内注射
肿瘤相关 基因功能 离体研究 肿瘤相关基因 功能在体研究
肿瘤细胞注 射入动物体 内成瘤
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功能检测
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功能检测
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81200471 Mir-135可通过调控HOXA10基因促进子宫内膜容受性的建立 81272747 81201443 81272666

IL-6通过miRNA调控Twist诱导胆囊癌CD133+CD44+肿瘤干细胞增 上海交通大学 殖的机制研究 受miRNAs调控的Smad3基因通过调节自噬减轻脓毒症肺损伤的作 中国人民解放军第二军医 用研究 大学 MiR-203下调Nanog表达抑制食管鳞癌上皮-间质转化及转移的机 中国人民解放军第二军医 制研究 大学 南京医科大学 山东大学
基因
基因操作
基因操作常规方法：过表达，RNAi
功能
功能检测
功能检测方向：增殖凋亡，转移，血管新生等
目标：确定候选肿瘤相关基因的生物学功能
机制
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