• 微卫星不稳定性的研究方法，目前主要以PCR技术
为基础研究微卫星不稳定性改变，步骤为：(1)首先 需确定特定染色体上特定微卫星位点标记，并根据 其序列合成特异性引物。引物序列一般可根据特定 位点直接从基因库中查询。（2）收集肿瘤组织及 相应正常组织标本，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，提 取基因组DNA。（3）PCR扩增。（4）扩增产物的 检测。常用凝胶电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下 观察，或放射自显影及银染等方法观察。（5）判 断结果。若肿瘤组织较正常对照组织出现某一基因 条带消失或密度减少50％以上，可判断为杂和性丢 失；若肿瘤组织出现基因条带的增多，即判断为不 稳定性改变。
微卫星不稳定性
09 生物科学 二组
• 微卫星(microsatellite,MS),是指DNA基因组中
小于10个核苷酸的简单重复序列, 又称短串联 重复(short tandem repeat, STR)，是一种遍布 于人类基因组的重复序列，一般为2～6个碱基 重复，如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等，尤以 (CA)n重复序列最为常见。其长度由重复单位 的拷贝数决定，是一类呈高度多态的遗传标记
• 微卫星不稳定性(microsatellite
instability,MSI)是指由于复制错误 (replication error, RER)引起的简单重复序 列的增加或丢失,也称RER阳性或RER表型。
• 1993年，Altonen等首次发现，在HNPCC细
胞中存在高频率的MSI后，又有很多学者在 多种肿瘤中发现MSI。MSI作为肿瘤遗传不 稳定一个敏感的检测指标已逐渐被大家接 受。
• 存在的问题：通过对人体多种肿瘤MSI的检测,目前已初步对体细胞中
MMR系统的功能以及MMR缺陷与肿瘤发生的相应关系有所认识,但此 仅仅是深入研究的开始而已,因为(1)人类MMR基因不仅具有识别和修 复DNA复制过程中出现的DNA错配的功能,有实验报道,该组基因还以 某种方式参与细胞对增殖的调控,其确切机理及调节方式有待进一步研 究。(2)大肠杆菌MutHLS系统中的MMR基因仅占大肠杆菌基因组中突 变控制位点(murator loci)的一半。除MMR基因外,其余占半数的突变 控制位点的基因组成了大肠杆菌细胞中的对突变产生具有明显抑制作 用的体系。由于细菌与人体细胞在MMR系统上表现出极大的相似性, 因而推测人体细胞除MMR系统外,也应含有类似于大肠杆菌的其它突 变抑制系统,该突变抑制系统也应该在维持人基因组稳定性上发挥重要 作用,其功能失活也参与了肿瘤的形成。目前,对人体细胞中可能存在 的此系统还不了解。(3)已有研究发现在hMSH2基因启动子区域含有 一个p53蛋白质的识别位点,据此推论, hMSH2基因可能是受p53基因调 控的一种靶基因,其正常功能在某种程度上依赖于p53基因的调节。因 而某些肿瘤组织中MMR缺陷并非由于MMR基因突变所致,可能与MMR 基因的调节基因变异有关。
• 在以后的研究中，相继在肺癌，胃癌，白血病
等其它肿瘤也发现微卫星不稳定性。Li等报道 一组100例包括头颈部肿瘤，膀胱肿瘤及肺癌 病例，用9个微卫星位点标记物筛选，发现3个 及4个核苷酸重复序列更易出现插入或缺失， 26例出现至少一个位点的改变。显示微卫星不 稳定性改变可作为肿瘤细胞的克隆标志，运用 于肿瘤的检测。肿瘤常在抑癌基因位点出现染 色体基因缺失，表现为等位基因杂合性丢失 (Loss of heterozygosity),通过检测分析肿瘤杂 合性丢失及其规律，可在染色体一定范围内发 现肿瘤的抑癌基因及易感基因。
• 目前已经知道,RER+癌患者RER阳性比例最高；(2)多位于右半结肠,易发生肠 内或肠外其它器官的多发性肿瘤,多发性肿瘤RER阳性率(80%) 明显高于单发性肿瘤(11%),术后易再发其它原发恶性肿瘤； (3)DNA多为二倍体或近二倍体；(4)对某些化疗药物(如顺铂)有 原发耐药性；(5)具有高突变特性,许多癌基因及抑癌基因(如 RAS,p53,APC等)突变数目明显增多；(6)粘液腺癌多见,组织分 化差,多浸润生长,肿块较大,但较少发生淋巴结转移,预后较好,而 RER-的大肠癌多发生在左半结肠,多为多倍体。晚期胃癌、远端 胃癌多为RER+,RER+表型在肠型和实体瘤中的频率显著高于印 戒细胞癌；近端胃癌早期多为RER-。这说明与RER+癌发病机 制不同。因此,检测不同肿瘤的MSI,对深入认识肿瘤病的基因变 化是十分有帮助的。目前,需大力开展对人体多种肿瘤MSI的检 测,了解各种肿瘤与MMR基因突变的关系,弄清肿瘤中MMR基因 的突变类型及作用方式,建立更为简便的基因突变的检查技术并 应用了临床。
• 目前已发现RER+肿瘤主要有3类：一类为散发性结
直肠癌,这一类肿瘤细胞核型为近二倍体,病人预后 较好；另一类为HNPCC病人发生的结直肠癌、子宫 内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为MSI,与 散发性结直肠癌比较,发病年龄较早；第三类为包括 肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤,这一类肿瘤 MSI发生频率相对较低。近年来研究证实RER+是 HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌的早期分 子标志,也是慢性髓细胞性白血病的晚期分子标志, 对肾母细胞瘤来说,不仅是晚期分子标志并与其恶性 程度有关,对胃癌来说,不仅是其早期事件,而且与癌 的恶性转移有一定联系。并发现MSI存在于病理证 实为阴性的肿瘤旁切缘组织。
，不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基
因的定位与克隆，而且可用于遗传性疾病的连 锁分析和基因诊断。
• 遗传物质的突变是导致人类许多疾病(包括肿
瘤)的主要原因,而引起遗传物质突变的直接诱 因是不同类型的DNA损伤。其中多种原因造成 的DNA双链分子的碱基错配是导致突变的主要 DNA损伤类型之一。大量研究表明,从细菌、 酵母到人体细胞都存在一种能修复DNA碱基错 配的安全保障体系,这种保障体系是由一系列 特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,被称 为DNA错配修复系统(DNA mismatch repair system,MMR)。人体细胞中由于MMR系统的存 在,可保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗 传物质突变的产生,保证DNA复制的高保真度 。