3.8 蛋白质印迹法
适用 1～5ng蛋白质，用于细 范围 胞中特异蛋白质的测定。
优点 灵敏度高，特异性强。
缺点 成本高，技术难度大。
3.9 高效液相色谱法
原理：酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在280nm处 有紫外吸收，吸光度与蛋白质含量成正比。反相 HPLC可以分析多肽，更大分子量的多肽需要用凝 胶过滤色谱柱。
1.鉴别
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10
化学反应 高效液相色谱（保留时间） 红外光谱（去氨加压素） 紫外光谱 肽图分析（重组肽） 核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林） 毛细管电泳（重组肽） 液质联用（去氨加压素） 圆二色光谱（测定蛋白质二级结构） 比旋度等
1.5 肽图分析
2.2-二辛可宁酸
3.4 BCA法
适用 范围
80～400μg蛋白质。
优点
抗干扰能力强，线 性范围宽。
缺点
受EDTA和二硫苏糖 醇等辅料干扰。
3.5 考马斯亮蓝法
原理：游离状态下呈红色 的有机染料，在稀酸溶液 中与蛋白质的碱性氨基酸 和芳香族氨基酸残基结合 后变为蓝色，最大吸收波 长从465nm变为595nm。 A595与蛋白质含量呈正比。
3.1 凯氏定氮法
适用 0.2～2.0mg氮，用于标 范围 准蛋白含量的准确测定。
优点
范围广泛，重现性好 误差±2%
缺点
灵敏度低，费时，测定 结果偏高。
3.2 福林酚法
原理：在碱性条件下，蛋 白质与铜作用生成络合物， 蛋白质中的酪氨酸和苯丙 氨酸残基将FolIn试剂中 的磷钼酸盐-磷钨酸盐中 六价钨还原成深蓝色混合 物。在650nm处的吸光度 与蛋白质含量成正比。
3.7 荧光分光光度法
适用 范围
微量和痕量药物的 定量分析。
优点 灵敏度高（1ng/ml）
缺点
高浓度溶液“自熄 灭”现象。
3.8 蛋白质印迹法
原理：将混合蛋白质进行 电泳分离，将产物电转移 到硝酸纤维膜上，以固相 载体上的蛋白质或多肽作 为抗原，与对应的抗体起 免疫反应，再与酶或同位 素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显 影检测蛋白成分。
原理：酪氨酸、苯丙氨酸 和色氨酸残基的苯环含有 共轭双键，在280nm处有 吸收峰，吸光度与蛋白质 含量成正比。
3.6 紫外分光光度法
适用 范围
测定与标准蛋白质氨基酸 组成相似的蛋白质样品
优点 简便，快速，样品可回收。
缺点
准确度差，嘌呤、嘧啶及 核酸类物质有较大干扰。
3.7 荧光分光光度法
原理：当溶液中含有表面 活性剂时，荧光染料分子 之间通过疏水相互作用形 成二聚体或多聚体，多聚 体的形成导致荧光强度降 低。然后加入蛋白质溶液， 导致多聚体解聚而使荧光 强度增加。在一定蛋白质 浓度范围内，荧光信号强 度与蛋白质的浓度成正比。
3.2 福林酚法
适用 范围
5～100μg蛋白质，用于测定 蛋白质的相对浓度。
优点
灵敏度高
缺点
专一性差，酪氨酸与苯丙氨酸 含量与牛血清白蛋白的组成比
例差距较大时测不准。
3.3 双缩脲法
原理：在强碱性溶液中，蛋白质肽键与Cu2+形成紫 色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与 蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
原理 • 样品与特殊基质混合形成 结晶，激光作用于晶体使 之直接气化并离子化。
优点 • 分析速度快，灵敏度高， 能忍受高盐样品。
缺点 • 背景信号大，不适于质荷 比太小的样品。
2.3 有关物质
工艺杂质 • 缺失肽，插入肽，未脱保 护肽。
降解产物 • 多肽氧化、还原、水解、 脱酰胺、二硫键错配。 聚合物 • 二聚体，多聚体。
原理：蛋白质与硫酸和催 化剂一同加热消化，使蛋 白质分解，分解的氨与硫 酸结合生成硫酸铵。然后 在碱性条件下蒸馏将铵盐 转化为氨，随水蒸气蒸馏 出来并为过量的硼酸液吸 收，再以硫酸或盐酸标准 溶液滴定，计算出样品中 的氮量。由于蛋白质含氮 量比较恒定，蛋白质含量 =含氮量/16%，可由其氮 量计算蛋白质含量。
3.3 双缩脲法
适用 范围
1～10mg蛋白质，用于快 速但不精准的蛋白质测定。
优点
简便，真实
缺点
灵敏度差，样品你需求量 大。
3.4 BCA法
原理：碱性条件下，蛋 白质与Cu2+络合，并将 其还原成Cu+，Cu+与 BCA试剂发生络合，使 其由原来的苹果绿形成 稳定的紫蓝色复合物， 在562nm处吸光度与蛋 白质浓度在广泛范围内 有良好的线性关系。
《中国药典》2015年版四部通则3405肽图检查法
第一法胰蛋白酶裂解——反相高效液相色谱法
供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后， 离心取上清。液相C18或C8柱，0.1%三氟乙酸的水和 0.1%三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长214nm。
第二法溴化氰裂解——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
供试品图谱与对 照品图谱进行比
3.9 高效液相色谱法
适用 范围
10-9～10-12g蛋白质。
优点
高灵敏度，快速分 析。
缺点
成本高，缺少通用 型检测器。
3.10 毛细管电泳法
原理：以毛细管作为分离通道，高压直流电场 驱动，按照毛细管中淌度、分配系数不同进行 分离的新型液相技术。
3.10 毛细管电泳法
适用 氨基酸、肽、多糖、 范围 蛋白质的分离分析。
不能用石英杯
Coomassie brilliant blue G-250
3.5 考马斯亮蓝法
适用 范围
2～500μg蛋白质，用于高灵敏度， 快速测定微量蛋白质。
优点
高灵敏度，应用最广泛。
缺点
标准曲线非线性，不能用beer定律， 测定的是相对含量，与各蛋白质中 精氨酸和芳香族氨基酸含量有关。
3.6 紫外分光光度法
2.1 氨基酸分析
2.1.1 酸水解 6mol/L盐酸，110℃，真空，20-24小时。
优点：氨基酸不消旋。
2.1 氨基酸分析
2.1.2 碱水解 5mol/L氢氧化钠溶液，充氮封管，110℃，22小时。
优点：色氨酸稳定。
2.1 氨基酸分析
2.1.3 酶水解 一组蛋白酶
优点：条件温和，氨基 酸不消旋，不被破坏。
目前《中国药典》 2015年版对于氨基酸 类制剂的杂质控制是 测定“其他氨基酸”， 采用TLC法喷茚三酮试 液显色。
其他杂质如何控制？
难点：种类多，分子 量小，弱紫外吸收， 两性电解质，溶解性 差异大。
杂质来源：不稳定氨 基酸，高温灭菌，生 产工艺差距。
2.2 分子量与分子量分布 2.2.1 分子排阻色谱
2.1 氨基酸分析
2.1.4 柱后衍生化 色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺） 反应。
优点：容易定量和自动化 操作。
2.1 氨基酸分析
2.1.5 柱前衍生化 氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基 甲酰等）反应，再分离检测。
优点：灵敏度高，分辨率 高，普通HPLC即可分析。
番外篇——氨基酸类药物的有关物质研究
蛋白质、多肽 类药物质量控 制
生化室 2018.4.13上海
蛋白质、多肽类药物
由50个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质， 所以蛋白质和多肽没有明显的区别。
优点：生物活 性高，特异性 强，毒性低。
缺点：稳定 性差，容易
失活
大分子，多组分。
太难
奥曲肽
醋酸戈那瑞琳
蛋白质、多肽药物质量控制
1.鉴别 2.检查 3.含量测定
光学杂质 • 消旋肽，非对应异构体。
2.3 有关物质
2.3.1 反相高效液相色谱
灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段。
2.3.2 毛细管电泳
消耗少，多种分离模式，操作简便。
2.3.3 液质联用
特异性强，极高灵敏度。
2.3.4 高效分子排阻色谱
用于高分子量蛋白物质检查。
2.4 热原
2.4.1 家兔法
兔子不稳定
2.4.2 鲎试剂
只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖
2.4.3 人全血细胞
新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽。
2.4.4 人源单核细胞系
针对不同热原-内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合 基质多样的生物大分子的热原检查。
2.5 残留溶剂
气相——顶空进样 最好不用液体进样，堵针，堵进样口。 不行就上气质联用。
优点 • 成本低，设备简单。
缺点 • 精确度相对较低。
2.2 分子量与分子量分布 2.2.3 ESI-MS
原理 优点 缺点
• 高压电场下通过库伦爆炸使蛋白质分 子带电（单电荷或多电荷）。
• 灵敏度高，准确度高。
• 设备昂贵，适用于强极性大分子量蛋 白质。
2.2 分子量与分子量分布 2.2.4 MALDI——TOF
优点 高效、快速、微量。
缺点
稳定性差，缓冲液 需精确配置。
谢谢！
韩春晖
原理 • 多孔凝胶为固定相，流动 相中组份分子量大的先流 出，分子量小的后流出。
优点 • 最简单，样品量少，条件 温和，设备简单。
缺点 • pH6-8范围内线性关系良 好，极端pH蛋白质变性， 误差5%左右。
2.2 分子量与分子量分布 2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理
• 样品预处理时加入SDS和巯基乙醇， 破坏蛋白质的二级和三级结构，使 之形成带大量负电荷的多肽链，使 分子泳动速率仅与其分子量有关。
较，即得。
事实是基本做 不出来一样的
肽图分析存在的问题
系统适用性在哪里？ 实验中复杂的前处理过程如何重现？ 粗犷的规定如何统一判定尺度？
向抗生素和中药学习，规定特征峰，给 出标准图谱，去溶剂峰，引入相似度评 价，给出推荐色谱柱，给出积分条件，