① 表达率高，稳定性好； ② 通过亲和层析容易对担体蛋白进行分离和纯化； ③ 可以帮助目的蛋白形成正确的空间结构。 ④ 容易将担体蛋白从目的蛋白中裂解出来。
6、构建融合蛋白表达载体的注意事项
目的蛋白 的方向
终止密码 子问题
目的基因 移码问题
终止密码子问题
EcoR I P1引物
TGA ACG
P2引物 BamH I
第二章 基因工程的工具酶与载体
第三节 表达载体 二、融合蛋白表达系统
表达载体的基本结构
表达蛋白的识别？ 表达蛋白的分离？ 表达蛋白的活性？ 蛋白表达的高效性？ 蛋白表达的可控性？
1、融合蛋白表达系统的概念
❖ 蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有 的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作 为一个新的开放阅读框进行表达。
3
、
pUC18/19 载体
融
合
蛋
白
表
达
载
体
MCS Lac Z α 目的蛋白
T7载体系统
His标签 + 目的蛋白
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合蛋白表达系统
GST 目的蛋白
加强GFP表达 的哺乳动物 细胞融合蛋 白表达质粒
目的蛋白 EGFP
GFP融合蛋白的表达
目的基因ZNF325
MCS
DNA T4连接酶
目的基因ZNF325
Sac I 6100bp Pst I 6100bp Sac I + Pst I
4700+1400bp
EGFP
COS7细胞系
4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收
化学断裂法： 溴化氰（CNBr） 甲硫氨酸残基
酶促裂解法 单残基位点与多 残基位点断裂法
蛋白内切酶 切割位点
梭菌蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶 假单孢菌蛋白酶 猪胰蛋白酶
启动子 担体基因接头 目的基因
Met
Stop
载体
2、用于融合蛋白构建的高表达的担体蛋白
β-半乳糖苷酶（LacZ） 容易识别、免疫亲和分离 绿色荧光蛋白（GFP） 容易识别 谷胱甘肽转移酶（GST） 免疫亲和分离、维持良好构象 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫亲和分离 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象
融合蛋白表达载体移码问题
ATG CCA GAC GGG CCC AAT ACC…TAA 目的基因
酶切末端加ATG之间的碱基序列必须是3的倍数！！
融合蛋白在体表达--IRES序列的引入
转基因斑马鱼 的载体
转基因果蝇的载体
Arg-C Glu-C Lys-C
Arg-C
Lys-C
担体蛋白
目的蛋白
N
Arg C N
C
4、融合蛋白中目的蛋白的分离和回收
酶促裂解法：多残基位点
亲和层析
启动子 担体基因接头 目的基因
表达
Met
Stop
Ile-Glu-gly-Arg
凝血因子Xa的识别、作用序列
Ile-Glu-gly-Arg
酶解回收
5、融合蛋白表达的优点