彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。

本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。

用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。

其余生化试剂均为分析纯。

电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。

1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。

实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。

1.5 细胞活性检测台盼蓝拒染法[10]即时检测经UV处理后K562细胞的活性。

1.6 彗星实验1988年Singh等[5]建立了碱性彗星实验，我们对该实验流程进行改良，首先改变了制胶方法，并在裂解后加入水洗的操作步骤，中和完成后再用梯度酒精脱水。

具体流程如下：①镀膜法制备底胶，将洁净的载玻片在0.2％的常熔点琼脂糖中浸没1 min后，置37 ℃孵箱烘烤过夜；实验时将细胞悬液与低熔点琼脂糖(42 ℃)以1∶1的比例在离心管中混匀，立即灌胶(先用盖玻片在已包被的载片上搭一个22 mm×10 mm×0.17 mm的小槽再灌胶)，4 ℃静置15 min后取下盖片，制得含细胞胶层。

②裂解，4 ℃，1 h。

③水洗，三蒸水4 ℃水洗3 次，5 min/次。

④解旋，4 ℃，20 min。

⑤电泳，4 ℃，20 min，0.8 V/cm。

⑥中和，3 次，每次5 min。

⑦梯度酒精脱水，(50％、70％、80％、90％、100％、100％，常温下各一次，每次5 min)。

⑧染色(EB，20 μg/ml，20 μl),之后镜检，每组随机取50 个细胞，用CASP分析软件进行分析[11～14]。

1.7 统计学方法实验数据进行t 检验。

2 结果2.1 改良实验方法的结果通过对制胶方法的改进，基本解决了实验中常见的脱胶现象。

同时经梯度酒精脱水后的彗星图象基本位于一个焦平面上(图1)，采图更为方便、可靠。

2.2 台盼蓝染色结果显示紫外线照射没有产生致死性损伤。

2.3 彗星实验结果由表1可知，UV照射K562细胞从最短的照射时间(3 s，0.9 mJ/cm2)开始，实验组尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩均大于对照组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。

当UV照射时间延长到240 s时，各参数不再增加。

从3 s到180 s，这些检测参数均表现出时间依赖效应。

表2的数据显示，实验组彗星头部半径、头部的面积、头部的DNA含量、头部平均荧光强度、头部DNA百分比随照射时间的增加，表现出振荡模式。

表3的实验结果显示，UV处理后，实验组细胞核DNA尾部的面积、尾部DNA、尾部DNA百分比均大于对照组，t检验有统计学意义(P<0.01)，且随UV照射时间的延长，除尾部平均荧光强度外，其它各参数下实验组表现出增加的趋势，显示出时间依赖效应。

3 讨论DNA分子中的共轭键可吸收较短波长的紫外线，从而导致自身发生损伤[15]。

彗星实验可以检测DNA链断裂损伤。

我们采用改良的彗星实验进行检测，用尾长、彗星长、尾矩，Olive尾矩作为分析指标，结果显示，0.3mW/cm2 UV照射3 s即可造成细胞DNA损伤，且随UV照射时间的增加，DNA损伤也增加，表现出良好的时间效应关系，说明改良的彗星实验方法和上述四种分析指标比较可靠。

当照射时间增加到240 s时，各分析指标有下降的趋势，表明彗星实验有检测的阈值，当细胞损伤程度超过此值后，该方法就不能够进行准确的检测。

当以尾部的面积、尾部的DNA和尾部的DNA百分比作为分析指标时，结果表现出时间依赖性，提示可以将这些参数用作DNA损伤的分析指标。

Durand等[16]分析了彗星图象的几种指标(尾长，彗星尾部DNA百分比，彗星尾矩)，发现尾矩这一指标具有分析范围广的特点。

我们的实验结果与他们的研究有较好的一致性。

由于尾矩、Olive尾矩等分析参数可以反映尾部的面积、尾部的DNA含量以及尾部的DNA百分比，因此选择尾长、彗星长、尾矩、Olive尾矩作为彗星实验的分析指标，均能较好反映细胞DNA的损伤程度。

而采用彗星头部半径、头部面积、头部DNA含量、头部DNA百分比和头、尾部的平均荧光强度作为分析指标时，损伤程度随UV光强的增加表现出振荡模式，提示这6种分析指标不适合用作彗星实验DNA损伤的评价指标。

综上，我们建立的改良彗星实验系统具有较好的可靠性，CASP分析软件可用于彗星实验的分析，彗星长、尾长、尾矩和Olive尾矩，均能较好地反映细胞DNA的损伤程度。

由Osting 和Johanson 于1984 年首先提出的微电泳技术,1988 年经Singn 等进一步完善为单细胞凝胶电泳( single cell gel elect rophoresis , SCGE) 。

SCGE 是一种在单细胞水平上检测DNA 链损伤的方法,其原理是:包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后,带负电荷的DNA 游离断片,在电场作用下向阳极迁移。

在荧光显微下观察,受损DNA 形成的影像形似夜空中的彗星,故又称“彗星试验”(Comet Assay) 。

彗星试验检测单细胞水平DNA 损伤,无需放射性示踪,适用于各种有核细胞,样品用量少,试验周期短,故而灵敏、快速、简便(1 ,2) 。

目前国内外对彗星试验研究的热点主要集中在两个方面:彗星试验的应用与方法学研究。

1 彗星试验的应用111 检测化学物质引起的DNA 损伤目前,对化学物质的DNA 损伤作用检测依然是彗星试验的主要应用范围。

自彗星试验建立以来,已有多种物质的DNA 损伤作用经过检测,对金属化合物、氧化剂、烷化剂、交联剂的研究都有报道。

近年来的研究不仅仅局限在物质是否造成DNA 损伤,在损伤机制、损伤与修复问题上已有了新的探索。

M.Tafazoli 等用彗星试验检测了五种氯化烷、烯类物质,结果证明:氯基数目的多少与双键是否存在使物质致DNA 损伤作用存在质和量的差别,含氯数目越多,DNA 损伤作用越强,带双键的烯类比无双键的烷类损伤作用强,说明物质的DNA 损伤作用与其结构密切相关(3) 。

Toshio Kasamatsu 将彗星试验改良,使细胞裂解后再染毒,并与传统彗星试验比较,结果发现:所检测的直接致突变物,在改良法和传统法中均得到阳性结果;需要经过代谢或膜作用才能对DNA 造成损伤的间接致突变物则只在传统法中得到阳性结果,在改良法中为阴性,这一研究成果对我们分析遗传毒物的化学与生物特性颇有参考价值(4) 。

112 化学物质的靶组织遗传毒性评价B. L. Pool2Zobel 等将从人体组织直肠获得的细胞克隆后,暴露于有致癌危险性的化学物中,观察形成直肠肿瘤的情况,该研究证明彗星试验能有效评估不同化学物质对靶组织的遗传毒性(5) 。

体外试验检测出的致突变物质,在机体内经代谢后,对整个机体的作用如何,对哪些组织具有遗传毒性,是否具有特异性靶组织,彗星试验体内试验研究将对其做出客观评价。

1. 3 辐射生物学研究过去的研究已证实彗星试验检测低剂量辐射引起的DNA 损伤快速、灵敏。

它可以监测接触放射线的人群DNA 损伤状况,监测肿瘤放疗前后DNA 损伤变化,总之,彗星试验已被广泛应用于辐射损伤的监测。

1996 年Takajj Ikushima 提出假说:辐射诱发DNA 损伤的有效修复机制的激发与放射适应性有关。

他们首先让细胞在37 ℃接受非损伤性低剂量辐射4h ,再以损伤剂量处理适应细胞和未适应细胞,发现适应细胞损伤修复率高。

这一发现使我们对辐射生物效应的研究打开了新思路(6) 。

1. 4 肿瘤细胞生物学研究1. 4. 1 凋亡与肿瘤:细胞凋亡与肿瘤的关系,是目前毒理学研究的一个崭新方向。

肿瘤的产生缘于机体内调节细胞增殖和死亡平衡的机制被破坏。

在肿瘤发生发展及灭亡过程中,细胞凋亡起着重要作用,对凋亡的进一步研究将对认识肿瘤的发生机制、预防及治疗肿瘤产生深远的影响(7) 。

凋亡发生时将产生180 —200bp 或其整数倍大小的DNA 片段,在彗星试验中呈现独特的小头大尾的形态学特征, (8) 因此,以DNA 损伤为检测终点的彗星试验可用于凋亡的检测。

1. 4. 2 肿瘤细胞药物抗性: Peggy Olive 等研究发现:肿瘤细胞亚群对DNA 损伤具有抗性(9) 。

由于彗星试验检测单细胞水平DNA 损伤,对细胞亚群的损—208 —伤情况,各细胞亚群对物质作用的反应是否均一都能得到明确的结果。

因此,彗星试验用于检测药物抗性细胞,能够为治疗方案的及时调整提供依据。

1. 5 生态毒理学1996 年G. Koppen 等首次将彗星试验应用于植物细胞- 蚕豆根尖细胞,他们将蚕豆根尖细胞以浸泡方式暴露在不同化合物的溶液中,观察DNA 损伤情况,发现甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、丝裂霉素C、氯化镉、重铬酸钾、氯化铬都能诱导蚕豆根尖细胞DNA损伤。

彗星试验用于植物系DNA 损伤监测,对于环境质量的评估非常有意义(10) 。