▪ 答疑：1.10 (9:00-11:30; 3:00-5:30) ▪ 地点：逸夫楼3楼生化实验室
三、探针(probe)
▪ 探针的概念 ▪ 探针的类型 ▪ 标记物的种类 ▪ 标记方法
1. 探针的概念
▪ 特异结合和检测靶分子的活性物质
– 抗原－抗体 – 配体－受体 – 同源DNA/RNA
杂交条件
▪ 靶分子 ▪ 探针 ▪ 杂交袋 ▪ 杂交炉
杂交种类
▪ 被检核酸种类和方法
– 原位杂交 – 斑点杂交 – Southern杂交 – Northern杂交 – Western杂交
▪ 反应介质
– 液相杂交 – 固相杂交(✓)
二、固相支持物
▪ 固相支持物的特性
– 结合能力强 – 不影响杂交反应 – 结合牢固 – 非特异性吸附少 – 机械性能良好
琼脂糖凝胶电泳
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
▪ 分离原理 ▪ 操作要点 ▪ 优点 ▪ 应用范围
（一）分离原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应
PAGE支持物
▪ 单体－丙烯酰胺(Acr) ▪ 交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis) ▪ 催化剂－过硫酸胺(AP) ▪ 加 速 剂 － N,N,N’,N’- 四 甲 基 乙 二 胺
2. 尼龙膜
▪ 特点
– 结合能力强 – 可反复杂交 – 韧性强 – 适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(10bp)结合能力强
▪ 不足
– 杂交信号本底较高
分子生物学考试
▪ 时间：2005.1.11(晚7:00-9:00) ▪ 地点
– 9教讲演厅 (150人) – 9-2-1 (50人) – 9-2-2 (50人) – 9-3-1 (50人)
固相支持物的种类
▪ 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)
▪ 尼龙膜(nylon membrane)
1.硝酸纤维素滤膜
▪ 特点
– 吸附ssDNA和RNA – 杂交信号本底低
▪ 不足
– 不适于重复杂交 – 滤膜较脆 – 不适于电转移印迹法 – 对DNA小片段(<200bp)结合能力弱
▪ 电泳的用途
– 分离 – 鉴定纯度 – 测定分子量
▪ 凝胶电泳的种类
– 琼脂糖凝胶电泳 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis)
▪ 分离核酸原理 ▪ 操作要点 ▪ 应用范围
（一）分离核酸原理
▪ 电荷效应 ▪ 分子筛效应 ▪ 分子构象
1. 电荷效应
试剂
制备浓度(%)
(ml) 3.5 5.0 8.0 12 20
30%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6
ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.7 5XTBE 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
10%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED
1. 支持物
商品化的琼脂糖
琼脂糖种类
普通 低熔点 高纯 高筛分
熔点 80~90℃ <70℃ 80~90℃ 80~90℃
机械强度 中
差
高
高
分辨率 中
差
中
高
2. 凝胶浓度的选择
凝胶的制备
3. DNA marker
DNA marker
DNA 长度标准曲线

4. 电泳缓冲液
▪ Tris-乙酸(TAE)pH 8.0 ▪ Tris-硼酸(TBE) pH 8.0 ▪ Tris-磷酸(TPE) pH 8.0
(TEMED)
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶
（二）操作要点
▪ 凝胶的分类 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ 凝胶液的配制 ▪ 凝胶中DNA的检测 ▪ DNA片段的回收
1. 凝胶的分类
▪ 非变性凝胶：dsDNA ▪ 变性凝胶: ssDNA
– 尿素 – 甲酰胺 – SDS
2. 凝胶浓度的选择
3. 凝胶液的配制
35ul/100ml
PAGE装置
电泳
4. 凝胶中DNA的检测
▪ 溴乙锭染色法 ▪ 银盐染色法 Ag+－DNA 甲醛
还原 ▪ 放射自显影法
Ag（黑褐色）
5.DNA片段的回收
▪ 压碎浸泡法
– <1kb – 纯度高，回收率低
（三）PAGE优点
▪ 机械强度好、化学稳定性高 ▪ 分辨率高 ▪ 载样量大 ▪ 回收的DNA纯度高
第十七章
分子生物 学常用技
术
分子生物学常用技术
▪ 凝胶电泳 ▪ 分子杂交 ▪ 聚合酶链反应(PCR)技术 ▪ DNA的物理图谱 ▪ DNA序列测定 ▪ 基因芯片
第一节 凝胶电泳
(gel electrophoresis)
▪ 电泳概念 ▪ 基本原理
Q μ＝
6πrη
μ: 迁移率
Q : 电荷量
r : 粒子半径（分子量） η: 介质粘度
（四）PAGE应用范围
▪ 分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA ▪ DNA序列分析 ▪ PCR产物鉴定 ▪ 蛋白质的检测和分析
第二节 分子杂交
▪ 分子杂交的基本原理 ▪ 固相支持物 ▪ 探针 ▪ 几种常用杂交技术
一、分子杂交的基本原理
▪ 核酸的变性和复性
分 子 杂 交
DNA-DNA
DNA-RNA
5. 样品制备
▪ 上样缓冲液
– 50%甘油/蔗糖 – 0.5%溴酚蓝/二甲苯青
点样
6.电泳条件
▪ 潜水电泳 ▪ 恒压电泳
– 低压: 1~2V/cm – 中压: 8~10V/cm – 高压电泳：>几十V/cm
▪ 温度：15~25℃
潜水电泳
7.电泳染色
▪ 溴乙锭(ethidium bromide, EB) ▪ 结构及染色原理 ▪ 染色方法
▪ 核酸是两性电解质
▪ pH = 3.5 ,
正电荷
▪ pH = 8.0~8.3 , 负电荷，正极
2.分子筛效应
▪ 小分子移动快 ，大分子移动慢
3. 分子构象
-
+
▪ 闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA
（二）操作要点
▪ 支持物 ▪ 凝胶浓度的选择 ▪ DNA分子量标准 ▪ 电泳缓冲液 ▪ 样品制备 ▪ 电泳条件 ▪ DNA电泳染色 ▪ DNA片段的回收
– 加入凝胶液中 – 电泳结束后染色
EB染色原理
紫外灯下显色
8. DNA片段的回收
▪ 低熔点琼脂糖法 ▪ 透析袋电洗脱法(>5kb) ▪ DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)
（三）应用范围
▪ DNA的分离、纯化和鉴定
– 限制性酶切图谱分析 – 重组体的分离、鉴定 – 杂交分析 – PCR产物的分离鉴定