第二章 微生物的纯培养和显微技术
[教学目标教学目标]] 通过本章的教学，使学生掌握什么是纯培养？微生物分离纯化的基本技术。
[教学的重点和难点教学的重点和难点]] 纯培养的概念和微生物的无菌操作技术。
[教学方法和手段教学方法和手段]] 应用多媒体授课，主要以讲授为辅，实验教学为主。
[教学内容教学内容]]
第一节第一节 微生物纯培养微生物纯培养
纯培养（（pure culture pure culture）：）：
）：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。
克隆：对于微生物，由于其主要进行无性繁殖，故纯培养即为克隆。
建立纯培养，证实其纯度无可置疑，并保持不受污染是微生物学家最重要的任务之一。
（即控制无杂菌）
一、获得纯培养的方法：
（一）.平板分离法：
1、划线分离法：快速、方便。
分段划线（（适用于浓度较大的样品适用于浓度较大的样品））
连续划线（（适用于浓度较小的样品适用于浓度较小的样品））
扇形划线
方格划线
分段划线法
2、稀释倾注分离法：
可定性、定量。
方法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。
3、涂布平板法（培养基表面出现菌落）
简单易行，但易造成机械损伤
（二）．液体分离法
适用于细胞较大的微生物。
用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。
（三）单细胞（单孢子）分离法
较大的微生物可用毛细管挑取单个个体；个体较小的微生物，需用显微操作仪，在显微镜下进行。
（四）.选择培养分离（通常做成固体的培养基） ：通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
1、利用选择平板进行直接分离
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，指定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
固体培养各种微生物形成的菌落特征：
二、纯培养的接种方法
根据菌的生长速度的快慢来选择 斜面接种、液体接种 。
（一）斜面接种：
为保存菌种和获得大量菌种
（1）密涂布法(适用于各种M，可获得大量菌体）
（2）蛇形划线法(适用于易扩散的M）
（3）中央划线法（适用于生长快的M）
（4）点种法（适用于真菌短时间保存菌种）
斜面接种示意图
（二）穿刺接种法：
用于接种试管深层琼脂培养基，以观察细菌运动及鉴定细菌用。
穿刺接种
（三）液体接种法
用接种针在液面边缘-----产生混浊------搅匀、振荡
注意事项：
1、小接种量、
2、用无菌滴管或移液管、
3、直接倒入、
4、利用无菌空气
通过特殊装置压入、5、利用负压吸入液体基中。
三、无菌技术
无菌操作：防止微生物进入物体的技术。
无菌：指没有活的微生物（包括芽孢）。
死亡：指不可逆地丧失了生长繁殖的能力。
除菌：应用机械的方法（过滤、离心分离、静电吸附）除去液体或气体中的微生物。
灭菌操作：杀灭所有微生物
常用 湿热灭菌：高压蒸汽灭菌
干热灭菌：空气加热灭菌
高温灼烧：用火直接接触烧灭
四、菌种保藏
传代培养保藏
冷冻保藏
干燥保藏
五、二元培养物
如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。
第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及原理
1.种类
普通光学显微镜
暗视野显微镜
相差显微镜
荧光显微镜
透射电子显微镜(transmission electron microscope TEM )
描电子显微镜(SEM )
扫描隧道显微镜 (STM ） 原子力显微镜(AFM)
早期的光学显微镜
2.原理
显微镜的作用主要是放大作用。
一般利用目镜和物镜两组透镜 来放大成像，组成由机械装置和 光学系统两大部分。
除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率和反差。
分辨率：指辨别两点之间最小距离的能力。
即最小可分辨能力。
0.5λ
分辨率=-----------
nsinθ
显微镜的分辨率的比较图，书 23页图2-10
反差：样品区别于背景的程度。
与显微镜的自身特点有关；
显微观察时对显微镜的正确使用；
良好的标本制作和观察技术。
二、显微技术
1、良好标本的制备
光学显微镜的制样 活体观察：压滴法、悬滴法、菌丝埋片法
染色观察 ：活菌染色和死菌染色（正染色和负染色）
电子显微镜的制样 透射电镜样品的制备
电子的穿透能力有限，需采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。
常用负染技术
投影技术
超薄切片技术
扫描电镜样品的制备:主要要求干燥 ，并且表面能够导电，常用自然干燥、真空干燥、冷冻干燥等。
干燥、喷镀金属导电层后观察。
2、分析技术
（1）对显微镜的正确使用 了解显微镜的构造和性能。
（2）观察技术 不仅观察物体的形态、结构，可进行的摄影技术，而且与计算科学技术结合的图像分析、模拟仿真技术。
（3）对物体的组成成分定性和定量。