人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定-最新文档
人牙龈成纤维细胞的原代培养及鉴定
The primary culture and identification of human gingival fibroblasts
CUI Juan1, SUN Keqin1, LI Xia1, ZHANG Huaping2
(1.Oral Medicine Department of Oral Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Central Laboratory of Oral Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)
[] Objective: T o isolate and culture human gingival fibroblasts (HGFs) in vitro, and provide the experimental condition for further research on the HGFs regulation by cytokines. Methods: HGFs were primary cultured by tissue explant culture technique and identified by morphological analysis and immunocytochemical analysis. Results: The HGFs were cultured and passaged successfully. The cells showed long spindle or star appearance. By immunocytochemical analysis, these cells tested positive to anti-vimentin antibody and negative to anti-keratin antibody, indicating the cells were mesoderm derived fibroblasts. Conclusion: The cells cultured by tissue explant culture technique are consistent with typical
HGFs' characteristics of morphology and immunocytochemical observation. The HGFs are used as cell model in vitro for future research on HGFs regulation by cytokines.
人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)是牙龈结缔组织中的主体细胞,在牙周组织的保护和修复中起重要作用[1]。
许多学者利用牙龈成纤维细胞体外培养模型,在牙周组织发病机制及治疗方面进行了有益的探索[2]。
原代培养是获取牙龈成纤维细胞的主要手段,
目前有酶消化法和组织块培养法[3]。
本实验采用组织块法培养人牙龈成纤维细胞,为进一步研究细胞因子对牙龈成纤维细胞的调控作用提供实验条件。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
DMEM培养液(Gibco,美国);胎牛血清(四季青,杭州);胰蛋白酶(Sigma,美国);抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(中杉金桥,北京);25 ml塑料培养瓶、六孔板(Orange scientific,比利时);RCO3000-7 CO2培养箱(REVCO,美国);GB-Ⅱ超净工作台(北京市新技术应用研究所);倒置显微镜(重庆光学仪器厂)。
1.2 实验方法
1.2.1 组织来源
牙龈组织取材于山西医科大学口腔医院口外科门诊因正畸
需拔牙或者因手术需切除牙龈且牙龈无炎症的患者,征得其同意后切取牙龈组织,患者年龄12～26岁。
1.2.2 组织块法培养及传代
新鲜切取的牙龈组织立即投入预冷含双抗的DMEM培养液中(含青霉素100 U/ml,链霉素100 μg/ml),在超净工作台中用5倍抗生素溶液浸泡消毒,在无菌培养皿中用眼科剪将牙龈组织剪成1 mm3大小(剪切时在组织块上滴加DMEM培养液,且尽量去除上皮组织),用牙科探针将组织块以均匀间距分散接种于25 ml培养瓶壁上,倒置培养瓶在CO2培养箱中(5% CO2,95%空气,100%湿度,37℃恒温)孵育4 h后翻瓶,加入DMEM培养液。
当细胞长至培养瓶底80%左右时,用0.25%胰酶消化,以1∶2或1∶3传代。
1.2.3 细胞的鉴定
1.2.3.1 形态学鉴定倒置显微镜下观察细胞由组织块边缘
游出的情况,观察细胞形态及传代后细胞生长状况。
1.2.3.2 免疫学鉴定细胞传至4代,制成1×105/cm2的细胞悬液,制备细胞爬片,按免疫组化试剂盒说明书及DAB显色步骤,分别进行抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体染色,以磷酸盐缓冲液(PBS)代替抗体作为
阴性对照组,光镜下观察染色结果。
1.2.4 细胞生长曲线
取4代生长状态良好的牙龈成纤维细胞,0.25%胰酶消化后,加入DMEM培养液离心,将细胞稀释为1×104~2×104/cm2,接种于96孔板中,200 μl/孔,每24小时测定一板,每孔加入20 μl
MTT培养4 h。
吸出上清加入150 μl/孔DMSO,室温下振荡10 min;490 nm处测定吸光度,绘制细胞生长曲线。
2 结果
2.1 细胞原代培养成功率
本实验共接种10例牙龈组织,其中8例组织块周围有细胞游出,游出时间为10~15 d,接种的10例组织无一例污染,6例在细胞游出30 d 左右长满瓶底并传代成功,其他2例未在30 d内长满瓶底且细胞有老化趋势,被淘汰,细胞培养成功率为60%。
2.2 细胞传代
细胞单层长满瓶底80%可进行传代,用0.25%胰蛋白酶消化,不同形态的细胞对胰酶敏感性不同,成纤维样细胞几分钟内即被胰酶从瓶壁上消化下来,以此可分离成纤维细胞和上皮源性细胞,传代后贴壁良好,形态不发生改变,生长速度加快,细胞长满单层,呈漩涡状、栅栏状、放射状排列。
2.3 细胞鉴定
2.3.1 形态学鉴定
倒置显微镜下,原代及传代生长的细胞呈长梭形或星形,核
呈圆形或椭圆形,有数目不等、长短不同的胞质突,核仁清晰可见,呈典型的成纤维样细胞形态。
原代培养的细胞以组织块为中心呈放射状生长,传代后的细胞呈放射状或漩涡状走行,排列紧密,有极性。
2.3.2 免疫学鉴定
光镜下对细胞进行免疫组化染色观察,显示细胞抗波形丝蛋白染色阳性,胞质内阳性颗粒均匀分布,胞核清晰、无染色;抗角蛋白染色阴性,证明细胞为中胚层来源,且无上皮源性细胞混杂。
阴性对照组均未见阳性染色结果。
2.4 细胞生长曲线
见图1。
图1HGFs的生长曲线
3 讨论
牙周病是发生在牙齿支持组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性非特异性感染性疾病,是导致成年人失牙的主要原因[4]。
随着老龄化社会的到来,牙周病尤其牙周炎更将成为突出的保健问题,是学者研究的热点和难点。
广义上牙周病包括牙龈炎和牙周炎。
牙龈炎是牙周炎的前驱和首要症状,防治牙龈炎可有效防止牙周炎的发生及发展。
牙龈成纤维细胞是牙龈结缔组织中的主体细胞,不仅具有活跃的自身更新能力,而且可合成胶原纤维、弹性纤维及基质[5]。
已有报道牙龈成纤维细胞具有一定的潜在成骨能力,使牙龈成纤维细胞有望成为牙周组织工程的种子细胞[6-7]。
此外,牙龈成纤维细胞的体外培养成活率高于牙周膜成纤维细胞,取材方便,创伤较小。
因此,体外建立牙龈成纤维细胞模型有利于今后对牙周组织炎症机制和防治措施的进一步研究。
细胞原代培养目前有酶消化法和组织块培养法,本实验利用
组织块法,操作简便,污染率低,创伤小,成活率较高,进一步证实组织块法是培养牙龈成纤维细胞的经典方法。
通过形态学和免疫学鉴定,细胞呈长梭形或星形,抗波形丝蛋白抗体阳性,抗角蛋白抗体阴性,证明是中胚层非上皮来源细胞,结合组织取材部位,证实本实验培养的是人牙龈成纤维细胞。
在传代培养过程中,由于操作和条件的限制,有时不能完全去除上皮组织而混有上皮源性细胞,但两种细胞对胰酶的敏感性不同,消化时间长短不同,因此可通过传代纯化成纤维细胞[3]。
细胞培养是进行多种实验研究的基础,组织中分离的原代细胞与体内细胞性状相似,较好地保存了细胞的遗传特征和生物学特性[8],又避免了体内研究所受的多因素干扰,使实验结果更为可靠。
但是体外培养的细胞反复传代性状有可能发生改变。
因此,体外培养的细胞要在稳定的状态下方可进行实验。
本实验通过对细胞的形态学观察及对绘制的细胞生长曲线进行分析显示,3~6代牙龈成纤维细胞形态结构稳定,生长状态良好,适于进行实验研究;8代以后细胞生长时间延长,细胞形态改变,有
融合老化趋势,不再适合进行实验研究。
细胞培养的成功与否受到很多因素的影响,①新鲜组织的消毒:尽量避免组织过多在外暴露及与其他有菌物品接触,实验中应用一定浓度的抗生素既防止污染又不影响细胞的生长;②减少影响接种时细胞贴壁的不利因素:接种4 h内应尽量不移动培养瓶,而且接种时组织块的湿润程度要适中;③培养液胎牛血清的
浓度:细胞从组织块游出过程中,培养液中胎牛血清的浓度高,更利于细胞生长;④无菌观念:操作的全部过程都要谨慎保持无菌观念,使细胞生长良好。
[。