2020/8/20
35℃,培养72小时.
再验证试验
500:冲洗液体积500ml; 700:冲洗液体积700ml.
(2)铜绿假单胞菌10104 (3)枯草芽孢杆菌 63501 (4) 金黄色葡萄球菌26003
• 总取样量：15g / 每株试验菌
2020/8/20
3
2
1
＋
+:对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml.
2020/8/20
35℃,培养24小时.
＋
1
2
+:对照管; 1:没有冲洗; 2:冲洗液体积200ml.
64901
10104
63501
26003
2020/8/20
5.稀释液以及冲洗液
• 0.1%蛋白胨水溶液 ——稀释液 （如果蛋白胨溶液浑浊，应过滤） • 聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 ——
非水溶液制剂供试品的冲洗 • 十四烷酸异丙酯 ——膏剂和粘性油剂的
溶剂 ，膜滤除菌
2020/8/20
6.供试品的无菌检查
35℃,培养48小时.
2020/8/20
结论2:
1. 红霉素对生孢梭菌生长无抑制作用. 2. 红霉素对铜绿假单孢菌生长无抑制作用
.
2020/8/20
＋
1
2
3
＋ :对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积400ml.
2020/8/20
35℃,培养72小时.
结论3:
1. 红霉素对枯草芽孢杆菌有抑制作用.
• 灵敏度检查 硫乙醇酸盐流体培养基
12ml，9支，4种菌，35 ℃培养3天；
改良马丁培养基
9ml，5支，2种菌，25 ℃培养5天。 结果判断:空白管应无菌生长,加菌管均生长良好
• 菌液制备（＜100 cfu/ml 的菌悬液）
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硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查 试验
生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌
• 薄膜过滤法 （选择供试品对其生长有抑制 作用的菌株做方法学考察）——考察冲洗量 以及其他灭活方法的效果
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直接接种法
（方法学验证试验 ）
• 取红霉素眼膏一支，无菌操作取出全部内 容物，移入含适宜乳化剂的稀释液中，充 分混合，作为供试液；
• 量取一定体积供试液（相当于固体取样量 150mg）置相应的培养基中；(改良马丁）
0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液冲洗薄膜
2020/8/20
加培养基培养14天
已知信息：
• 上市抽检样品 • 膏剂和粘性油剂供试品 • 规格：2.5g：12.5mg红霉素 • 薄膜过滤法（阳性对照增加1/2最小检验量）
依据以上的检品信息，查表3确定最少 检验数量以及最少取样量
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15支，每支取样1克，总接入量15克 • 冲洗液用量：2100ml，（700ml/筒） a.阳性对照—金黄色葡萄球菌（＜100 cfu
）
b.供试品 c.阴性对照 • 硫乙醇酸盐流体培养基 2•020/8改/20 良马丁培养基
结果判断 规定温度，培养14天 供试品
a.无菌生长，同时阳性管有菌生长 符合规定 ☺ √ b.有菌生长 不符合规定 Χ
• 接入相应的试验菌 （黑曲霉 or 白色念珠菌）
• 同时做阳性对照
• 25℃培养3～5天，逐日观察
/8/20
结论1:
1. 红霉素对黑曲霉生长无抑制作用. 2. 红霉素对白色念珠菌生长无抑制作用.
2020/8/20
• 薄膜过滤法——考察冲洗量 （方法学验证试验 ） • 试验菌： (1)生孢梭菌64901
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3.培养基
• 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃
红色氧化层（h＜深度的1/5）， 100℃水浴加热除去氧化层，
时间不超过20分钟
• 改良马丁培养基
23～28℃
2020/8/20
灭菌后放置3天的培养基
沸水浴 加热10min
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4. 培养基的适用性检查
• 无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支（瓶）,培养14天 ,应无菌生长。
2. 每筒加样量5g(相当于红霉素25mg), 冲洗液体积400ml,枯草芽孢杆菌48小 时后可见微弱生长,72小时生长良好.
3. 在该检验条件下,冲洗400ml,三天内可 检出枯草芽孢杆菌.
2020/8/20
＋
1
2
3
+:对照管;
1:没有冲洗;
2:冲洗液体积200ml; 3:冲洗液体积
400ml.
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提纲
1.定义 2.常见检验品种 3. 4.培养基及培养基的适用性检查 5.稀释液以及冲洗液 6. 无菌检查法实例 7.方法学验证试验
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1.定义:系指用于检查药典要求无菌的药 品、医疗器具、原料、辅料及其他品 种是否无菌的一种方法。
<符合规定>的意义: 仅表明了供试品在该检验条件下未发 现被微生物污染。
• 作用：溶解膏剂中的凡士林，使红霉素 分散均匀。
• 十四烷酸异丙酯实际用量25ml • 萃取液：0.1%蛋白胨水溶液200ml • 冲洗液：（检细菌、检真菌、阳性对照）
0.5%聚山梨酯80-0.1%胨水溶液2100ml （阴性对照：冲洗液400ml）
2020/8/20
小结：
• 薄膜过滤法： 阳性对照增加1/2最小检验量 检验数量：
明确检验数量 与检验量 根据供试品的情况，确定检样数量
• 批出厂or上市抽检； • 固体制剂or液体制剂； • 直接接种法or薄膜过滤法
参考药典附录90-91页表1，表2，表3
2020/8/20
示例：红霉素眼膏——无菌检查
• 检验流程：取规定量供试品
十四烷酸异丙酯溶解
0.1%蛋白胨水溶液萃取
取水相作为供试液薄膜过滤
c.试验结果无效，须复试 ① 设备环境原因 ② 试验过程染菌 ③ 阴性管有菌生长 ④ 无菌操作不当 d.阳性管规定时间内无菌生长 （2~3天内 ）
须重新进行方法验证
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7.方法学验证试验
• 当供试品为新的产品或供试品的组分、检验 条件发生改变时， 需进行方法学验证
• 直接接种法 （6个菌株） ——考察供试品是 否有抑菌作用
• 本品装量2.5g ：300mg≤ M ＜ 5g • 最少检验数量—— 供试品 + 阳性对照：
10 + 5 = 15 支 • 每支最少取样量 ：150mg
• 每支实际取样量：1g左右 （约为装量的2/5）
• 共计的接入量——15克左右
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• 十四烷酸异丙酯的用量约为供试品总接 入量的1倍～2倍左右。