环境微生物分子生态学研究方法综述摘要：对当前国内外环境微生物多样性的分子生态学研究方法进行了总结和探讨，包括微生物化学成分的分析的方法和分子生物学的方法，以目前比较成熟前沿的分子生物学的方法16S rRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)/温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制性片段长度多态性(RFLP)和扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制性片段多态性(T-RFLP)、单链构象多态性(SSCP)为例。

在环境微生物多样性研究中，如果可能的话，需要将各种方法结合起来使用，方可掌握有关环境生物多样性的较为全面的信息。

更好的揭示环境变化现状和预示环境的变化趋势，为环境改善修复提供有利依据。

关键词：环境微生物；分子生物学；DGGE；ARDRA；T-RFLP1 引言环境微生物是指环境中形体微小、结构简单的生物，包括原核微生物(细菌、蓝细菌、放线菌)、真核生物（真菌、藻类、地衣和原生动物等）。

数量庞大、种类繁多的环境微生物是丰富的生物资源库[1]，也是环境中最活跃的部分，全部参与环境中生物化学反应，在物质转换、能量流动、生物地球化学循环及环境污染物的降解和解毒[2]过程中具有极其重要的作用，亦是评价各种环境的重要指标之一。

比如土壤微生物的数量分布，不仅可以敏感地反映土壤环境质量的变化，而且也是土壤中生物活性的具体体现[3]。

河道、湖泊中微生物量也可以反映该水体的健康状况。

微生物群落结构和多样性是环境微生物生态学研究的热点内容。

微生物群落结构的研究主要通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响，揭示环境质量与微生物数量和活性之间的关系[4]。

微生物群落多样性，是指土壤微生物群落的种类和种间差异，微生物群落多样性包括物种多样性、遗传多样性及生理功能多样性等[5]。

物种多样性是群落中的微生物种群类型和数量，其中丰度和均度是多样性指数中的两个组成部分，也是多样性分析中最直观、最容易理解的要素。

研究微生物多样性的传统方法是将微生物从环境中分离、实验室培养和鉴定[6]。

然而，微生物种类繁多，自然界中仅有极少数微生物得到鉴定。

现代分子生物学方法为全面掌握微生物多样性提供了可能。

2 微生物化学成分的分析的方法根据细胞生物学相关原理，不同种类微生物细胞的化学组成也不一样。

根据微生物化学成组成进行微生物多样性分析是分析微生物群落的方法之一。

经过发展研究，主要有：1.1 群落水平生理学指纹方法(CLPP)微生物所含的酶与其丰度或活性密切相关的。

如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。

由Garland和Mills[7]于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)，是一种通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。

具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。

近年来，国内有韩蕙等人[8]利用BIOLOG YT、FF微孔板分别考察了4个真菌群落代谢活性及群落间的代谢相似性,并与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）结构相似性分析对比试图探讨代谢相似性与结构相似性的内在联系,探讨了超低温冻存法作为样品保存手段对真菌群落特征BIOLOG分析结果的影响。

还有杨永华等[9]用CLPP方法对农药污染土壤中的微生物群落进行了研究，测定结果显示，污染土壤的Shannon指数和均度、Simpson指数、Mclntosh指数和均度都明显低于无污染的土壤。

这表明，农药污染导致了土壤中微生物代谢功能多样性的下降，同时也导致了微生物种类的减少。

1.2 生物标记物法（Biomarkers）生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。

特定的Biomarkers标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。

生物标记物法（Biomarkers）包括：醌指纹法(Quinones Profiling)；磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析法；目前应用最广的是PLFA和FAME两种。

以脂肪酸甲酯分析法为例，脂肪酸甲酯分析法就是基于生物标记分子基础之上，不依赖微生物培养技术，提供微生物种群中脂肪酸组成信息的一种分析法。

脂肪酸是细胞中相对稳定的组成成分，不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异，它和微生物的遗传变异、耐药性等有极为密切的关系。

大多数革兰氏阳性菌(G +)中支链C15:0脂肪酸丰度很高，而在大多数革兰氏阴性菌(G -)菌中C16：0丰度较高[10]。

一些细菌如考克斯氏体属、土拉弗朗西丝菌属[11]、假单孢菌属和结核分枝杆菌属细菌[12]有其特殊的脂类，可经磷脂脂肪酸分析实现鉴定，因此脂肪酸图谱的改变就代表着微生物种群的改变。

FAME 法已经广泛应用到化学物质污染和农业生产活动引起的微生物种群组成和结构改变的研究中[13]。

近些年来，磷脂脂肪酸分析方法也逐渐被应用于土壤微生物多样性的研究中来，并作为土壤微生物种群变化的监测指标[14]。

3 以PCR 为基础的分子生物学分析方法用于微生物群落结构分析的基因组DNA 的序列包括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。

最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。

rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标。

16SrDNA 广泛存在于所有原核生物的基因组中。

序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。

应用分子生物学方法，克服了传统微生物生态学研究技术的局限性，能获取更加丰富的微生物多样性信息，推动着当今微生物生态学研究的进一步发展。

下面介绍近年来分子生物学在微生物生态学研究中较为成熟的技术。

如图1，图1是分子生物技术在微生物多样性研究中的应用图解。

RFLP 、RAPD 、AFLP 等样品DNA 提取纯化PCR 反应DGGE 切割并纯化rDNA 片段克隆测序检测微生物遗传多样性图1 分子生物技术在微生物多样性研究中的应用图解2.1 16S rRNA 基因序列分析16S rRNA 基因序列分析主要是基于已建立的16S rRNA 基因序列数据库，用于确定细菌的系统发育来判断物种间进化关系，通过比较16SrRNA 基因的序列，可确定新的离菌株在进化上的地位，并使序列探针能够识别未知菌。

目前，16S rRNA 基因序列分析已被广泛应用于微生物多样性的研究，为微生物的系统发育和未知菌的鉴定提供了全新的方法，并取得了一些有意义的结果。

1970年Woese 利用16S rRNA寡核苷酸序列分析技术，发现了一类在系统发育上与其它细菌存有很大差异的微生物-古细菌，奠定了有关古生物、真细菌和真核生物“三域”理论的基础[15,16]。

戴欣等[17]通过构建16S rRNA基因库对中国南海南沙海区沉积物中的细菌多样性进行了分析,表明在中国南沙海区沉积物中存在丰富的微生物多样性,并潜藏着特有的微生物资源。

孙磊等[18]通过对水稻内生细菌16S rRNA基因克隆文库中阳性克隆的序列测定证实引物对799f-1492r完全适用于非培养的分子生物学方法对水稻内生细菌的研究，对水稻（Oryza sativa L.）内生细菌和根结合细菌群落多样性及群落动态变化进行了分析。

2.2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)／温度梯度凝胶电泳(TGGE)DGGE／TGGE是两个相似的研究微生物多样性的方法。

这种技术最初是为了检测DNA序列中的点突变。

Muyzer等[19]1993年开始利用这个技术来研究微生物的遗传多样性。

主要步骤是：提取土壤样品中的DNA，利用通用引物PCR扩增16S或18S中的目的片段，在变性剂梯度或者温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳。

为了保证DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中分离时至少部分DNA保持双链，在正向引物的5 端加上35~40个碱基的GC发卡，否则在梯度凝胶中DNA将完全变性成单链。

理论上，DGGE可以分开只有一个碱基差别的DNA序列。

DGGE／TGGE方法可以探测到低丰度的种群。

段学军等[20]。

利用DGGE技术评价了重金属镉污染对土壤微生物群落影响。

研究发现，不同浓度镉胁迫下稻田土壤间的菌种有明显差异。

罗海峰等[21]用此技术检测乙草胺对农田土壤细菌多样性影响，结果显示，乙草胺在一定程度上改变了土壤细菌的多样性，特别是对土壤中的Proteobacteria 的α-Proteobacteria和β-Proteobacteria的影响明显。

王晓丹等[22]以北京翠湖湿地污水塘、表流湿地和潜流湿地为研究对象，在了解水质的基础上，采用PCR-DGGE 和16S rDNA文库技术对样品细菌多样性和优势群落结构进行分析。

结果表明在水质有明显变化的同时，微生物数量、细菌多样性及优势群落都发生了明显变化。

DGGE／TGGE可信度高，重复性好，快速，同时可以分析多个样品，相对较经济。

但是DGGE／TGGE受样品DNA提取质量、PCR结果的影响较大。

另外，不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中也可以有相同的移动特性，因此，一个条带不一定就代表一个种[23]。

在利用DGGE／TGGE图谱得到的部分种群指纹信息进行多样性研究时，还可以对特异性的条带割胶回收，PCR扩增并测序，或转膜与特异性引物杂交，这样就可以提供更多有关群落内部特定类群的信息。

同时，一些研究者已经开始用DGGE研究代谢基因，比如甲烷加氧酶[24]。

这将提供土壤微生物的特殊功能(例如污染物降解功能)多样性的信息。

2.3 单链构象多态性(SSCP)同DGGE／TGGE一样，SSCP技术最初是用来检测DNA已知或者特异构象，或者点突变的。

由于二级结构不同，单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶中泳动速度不同，借此而被分开。

当DNA片段大小相同且没有变性剂存在的情况下，DNA序列决定了泳动的速度。

该方法已经应用到根际微生物种群组成、厌氧反应器中细菌群落变化等方面的研究中。

然而一些单链DNA可以形成不止一个稳定的构象，因此在凝胶中多个条带可能代表同一种序列。

Vacca等[25]利用PCR-SSCP图谱分析六个处理生活污水的实验型人工湿地进出口、植物根区及基质不同深度的微生物群落的多样性，以判断湿地中填料类型、植物种植与否对菌群的影响，结果发现不同的微生物群落的存在与基质类型有关。

谢冰等[26]利用PCR-SSCP技术对上海梦清园芦苇人工湿地进出口微生物的多样性，得出异养菌、硝化细菌和反硝化细菌各个季节的分布不一，微生物功能群的分布与湿地中不同营养水平有关。