一种抗真菌抗生素的分离纯化及初步鉴定摘要:从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,编号为WS-23883,其发酵提取物对多种植物病原真菌具有很强的抑制活性｡对其产物进行提取精制及制备液相纯化,获得了纯度达90%以上的化合物｡生测表明,在20 μg/mL浓度下该抗生素对多种植物病原真菌的抑制率达100%｡根据活性产物紫外吸收光谱,可判断其为一多烯大环内酯类抗生素｡质谱分析表明,活性化合物分子质量约667 u,据此判断其为一四烯大环内酯类抗生素｡关键词:多烯大环内酯;抗生素;化合物;纯化;鉴定Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal ActivityAbstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic.Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization 从海南五指山采集的土样中分离到一株放线菌,其发酵提取物对多种供试植物病原真菌及某些腐生真菌具有很强的抑制活性｡采用常规方法对该菌的发酵产物进行了提取精制,得到了纯度在90%以上的样品,从目标产物的紫外吸收光谱可判断其为一多烯类抗生素｡HPLC-MS检测表明,活性产物分子离子峰为667,可以确定其分子质量约为667 u,综合分析后确定其为一四烯大环内酯类抗生素｡1材料与方法1.1菌株1.1.1抗生素产生菌编号为WS-23883,从海南五指山采集的土样中分离得到,由湖北省生物农药工程研究中心保存｡1.1.2生测指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)､小麦颖枯病菌(Septoria nodorum)､小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)､水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)､水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)､毛霉(Mucor sp.)均为湖北省生物农药工程研究中心保存｡1.2培养基1.2.1种子培养基葡萄糖-酵母粉-麦芽提取物培养基｡采用带挡板的500 mL三角瓶,装量100 mL｡1.2.2抗生素发酵培养基甘露醇-豆胨液体培养基｡采用带挡板的500 mL三角瓶,装量100 mL｡1.2.3生测培养基采用PDA培养基｡用管碟法生测时,下层琼脂质量分数为1.5%,上层琼脂质量分数为1.0%｡用96孔板进行生测时,琼脂质量分数为0.8%｡1.3主要仪器设备B?譈CHI ROTA V APOR R-200型旋转蒸发仪,瑞士生产;分析型液相色谱仪:Waters 2690采用2996二极管阵列式检测器;制备型液相色谱仪:Waters 2525泵,2767自动收集系统,2996二极管阵列式检测器;液质联用分析仪:Waters 2695高效液相色谱仪,采用Waters 996二极管阵列式检测器,Masslynx V4.0色谱工作站,美国Micromass Quattro micro?誖四极杆质谱仪,电喷雾离子源(ESI),Masslynx V4.1液质联用分析软件｡1.4主要试剂色谱纯级甲醇､乙腈均为天津基准试剂有限公司生产;分析纯乙醇,西陇化工股份有限公司生产;大孔吸附树脂D3520,南开大学化工厂生产;液质联用氮气,购自武汉市汉阳钢厂,纯度为99.999%｡1.5色谱条件1.5.1分析条件采用美国Sunfire C18柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min｡1.5.2制备条件制备柱采用美国Sunfire OBD C18柱,250 mm×19 mm,粒径为10 μm;柱温为室温;流动相为水和乙腈,进样量为3 000 μL;流速为27 mL/min;检测条件:二极管阵列,全波长扫描｡1.5.3质谱检测条件电喷雾电离(ESI),毛细管电压为3.5 kV,锥孔电压为45 V,离子源温度为100 ℃,干燥气温度为300 ℃,脱溶剂气体流速500 L/h,锥孔气体流速为50 L/h｡1.6主要方法1.6.1抗生素发酵取低温(-20 ℃以下)保藏的WS-23883甘油管1支,在严格无菌条件下用吸管取 1 mL甘油-菌丝悬浮物转入种子培养基中,在旋转式摇瓶机上28 ℃､140 r/min培养4 d后转入发酵培养基中,接种量为10%(V/V),相同条件下培养5 d后结束发酵｡1.6.2发酵液处理将发酵液用稀盐酸调pH值至5.0后,5 000 r/min离心10 min,将菌丝体和上清液分开｡1.6.3上清液过柱及洗脱将经预处理的大孔吸附树脂装入50 mm×1 000 mm四氟砂芯玻璃柱中,将上清液以10倍柱料体积,按BV=0.5~1.0的流速过柱,再以4倍于柱料体积的纯净水洗涤,用2倍于柱料体积的75%(V/V)乙醇洗脱,每200 mL收集1份｡1.6.4菌丝体萃取称取菌丝体质量(湿体),加入2倍体积的75%(V/V)乙醇,充分搅匀后,转入带挡板的500 mL三角瓶中,每瓶装量200 mL,置摇床上180 r/min振荡萃取1 h,然后于5 000 r/min离心10 min,倒出上清｡菌丝残渣用同样的方法再萃取1次｡合并2次萃取液,置旋转蒸发仪上在50 ℃､160 r/min,7 kPa压力下浓缩至原体积的1/5,置4 ℃静置过夜析出结晶｡1.6.5样品干燥将上述结晶物离心,再以纯水洗涤,再次离心以去掉可溶性杂质｡将沉淀物用纯水悬浮,转入不锈钢冻干盒中,冰冻干燥,即得奶黄色疏松粉末｡过柱后的洗脱液旋转蒸发除去乙醇后冰冻干燥｡1.6.6样品活性测定称取1 mg样品,加入纯水,溶解后制得1 000 μg/mL溶液｡以毛霉为指示菌,用管碟法测定样品活性｡1.6.7样品分析称取上述样品1 mg,加入1 mL甲醇溶解,10 000 r/min离心5 min,再以Mill ipore 0.5 μm膜过滤,HPLC分析,进样量3 μL｡2结果与分析2.1提取物活性测定生物活性测定结果表明,WS-23883的提取物对5种真菌菌丝的抑制率均达到100%,表明其有很强的抗真菌作用｡2.2精制样品分析生测及HPLC分析(图1)表明,样品中主要活性物质保留时间为14.02 min,杂质峰很小,用面积积分法算出样品纯度在90%以上｡从样品紫外吸收光谱(图2)来看,呈典型的指状吸收峰,最大吸收波长为291､304､319 nm,以304 nm吸收最强｡根据文献资料[1,2],该化合物应属多烯大环内酯类抗生素｡2.3样品HPLC-MS分析从质谱图(图3)可以看出,在正离子和负离子质谱中各有一个较强的峰,分别为668.0和666.3,因而对应的分子离子峰为667,从而确定该活性化合物分子质量为667 u｡查已知多烯类抗生素数据可知,与该化合物最相近的是匹马菌素(Pimiricin)[3,4],其分子质量为665.7 u｡两者质量数相差1个单位,是仪器误差还是二者非同一物质,尚待进一步分析｡3小结与讨论多烯大环内酯类抗生素是一类具有多个共轭双键的抗生素,其紫外吸收呈指状,特征非常明显,因而根据紫外吸收光谱很容易判断｡根据共轭双键的数目,多烯类抗生素可分为三烯､四烯､五烯､六烯､七烯等5类｡由于共轭双键的向红效应,其最大吸收波长会随着双键数目的增加而增加,根据最大吸收波长即可判断此类抗生素的归属[2]｡多烯大环内酯类抗生素通常具有很强的抗真菌活性,且抗真菌谱广,对丝状真菌､酵母等均有活性｡其最大弱点是对紫外光很敏感,因而多用在医疗方面,如制霉菌素(四烯)､两性霉素B(七烯)常用于抗真菌感染,纳他霉素[4](四烯)可用于医药及食品添加剂,等等｡多烯大环内酯类抗生素也有用于防治农作物病害的例子,如菲律宾菌素[3](五烯)可用于防治农作物曲霉､青霉病,梧宁霉素(四霉素,四烯)可用于防治水稻稻瘟病[5]､苹果腐烂病[6]等｡很多农作物真菌病害如萝卜､白菜根肿病,棉花黄萎病,西瓜枯萎病等是通过土壤传播的,多烯大环内酯类抗生素在土壤中使用可大大削弱紫外线的作用,因而有可能用于作物土传性真菌病害的防治｡参考文献:[1] MURA S. Macrolide antibiotics [J]. Chemistry and Biology,1970(8):139-150.[2] 顾觉奋.分离纯化工艺原理[M].北京:中国医药科技出版社,1996.301-306.[3] 张志平,姚天爵.抗生素与微生物产生的生物活性物质[M].北京:化学工业出版社,2005.362.[4] 梁景乐. 纳他霉素高产菌株空间育种､工艺优化及工业放大研究[D].杭州:浙江大学,2005.[5] 韩润亭,张金花,任金平,等.生物农药梧宁霉素防治水稻稻瘟病田间药效试验[J].现代农业科技,2008(14):112-113.[6] 董德鑫,邢歧,李文珍,等.梧宁霉素发酵液防治苹果腐烂病试验[J].中国果树,1990(2):34-35.。