特点：快速、简便；但易受干扰。
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7.生理指标法
▪测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主 要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌 为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25， 就可测得粗蛋白的含量。 ▪其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧 化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
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4。薄膜过滤计数法
常用该法测定含菌量较少的空气和水中 的微生物数目。
将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄 膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留 在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计 算菌落数，可求出样品中所含菌数。
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5.干重法
将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离 出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、 100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的 10%—20%，而一个细菌细胞一般重约1012—10-13g。
第六章微生物的生长与环境因子
Microbial Growth
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第一部分：微生物的生长
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢， 当同化作用>异化作用时，生命个体的重量和体积不 断增大的过程。
繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
发育——从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、 从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。
首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释 的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释 后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的 试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来
的纯培养物.
这种方法适合于细胞较大的h微生物.
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（2）平板划线分离法（Streak Plate）
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加速期
减速期
①.停滞期（lag phase）
其它名称：迟滞期、调整期、适应期
1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。
2.特点：P117
➢生长速率= 0
➢细胞形态变大或增长
➢细胞内RNA特别是rRNA含量增高
➢合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生 诱导酶
➢对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素 等化学药物）
应用范围：实验室科学研究及污水生物处理。
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恒化器Chemostat 或bactogen
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恒浊连续培养
概念：调节培养基流速，使培 养液浊度保持恒定的连续培养 方法。
原理：通过调节新鲜培养基流
入的速度和培养物流出的速度
来维持菌浓度不变,即浊度不变。
主要采用恒浊器，当浊度高时，
使新鲜培养基的流速加快，浊
Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤
37 23.5
Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖
25
344~46
Mycobacterium tuberculosis（结核h 分枝杆菌）组合 792~93
37 4
第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法
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5
一、获得纯培养的方法
单批培养
连续培养
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时间
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恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌 生长速率恒定的方法。
原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、 生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而 达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在 低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。
特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速 率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产 量低于最高菌体产量。
• 生长曲线可以细分为六个阶段、四个时期： 延迟 期（停滞期）、加速期、 对数生长期、减速期、 稳定期（静止期） 、 衰亡期（或死亡期）。 (P116)
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延对 滞数 期期
稳定期
典型的生长曲线 （Growth curve）
衰亡期
时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同
3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产
物
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★影响延迟期长短的因素：P116-117
◆菌种 ： 繁殖速度较快(世代时间短)的菌种的延迟期 一般较短；
◆接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延 迟期较短，甚至检查不到延迟期；
◆接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除 延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）；
B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤
30 18
B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤
55 18.3
Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶
37
66~87
Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶
37 26
S. lactis
乳糖肉汤
37 48
◆营养：培养基成分 ◇在营养成分丰富的天然培养
基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；◇接
种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所
以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基
接近。
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认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：
★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完 成操作），严格无菌操作；
★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀 处理，倾注平板时的培养基温度；
★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生 长的微生物，
★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于 样品内菌体分布不均匀、以及不当操作
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2 连续培养（continuous culture）
• 连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的 过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌 体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处 于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性 处于某种稳定状态。
• 类型：恒浊连续培养和恒化连续培养(P119)
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（1）连续培养原理
原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时， 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢 流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物 就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。
连续流入 新鲜培养液
单批培养 恒浊法
连续培养 恒化法
lg细胞数（个/ml）
纯培养(pure culture)
微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培 养繁殖而得到的后代,称纯培养.
（1）液体稀释法 （2）平板划线分离法（Streak Plate） （3）平板涂布分离法（Spread Plate） （4）选择性培养分离法 （5）单细胞（单孢子）分离法
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（1）液体稀释法
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3.平板菌落计数法
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★A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.
应用 范围
恒浊器 菌体密度 无限 （内控制） 制生 长因 子
恒化Байду номын сангаас 培养基流 速（外控 制）
有限 制生 长因
子
不恒定 恒定
最高
低于最 高
大量菌体 或与菌体 形成相平 行的产物
不同生长 速率的菌
体
生产 为主
实验 室为
主
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二、细菌的纯培养生长曲线
• 将少量细菌接种到一种新鲜的、定量的液体培养 基中进行分批培养，定时取样计数，以细菌个数 或细菌数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标， 连接坐标纸上各点成一条曲线即细菌的生长曲线。
简单易行，但易造成机械损伤
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（4）选择性培养分离法
为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生 物，可以根据该微生物的特点，包括营养、 生理、生长条件等，采用选择培养的方法进 行分离。
＊利用选择培养基进行直接分离 ＊富集培养
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（5）单细胞（单孢子）分离法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或 单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要 在显微镜下进行。
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个体生长与群体生长
个体生长——微生物细胞个体吸收营养物质，进行新 陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。
群体生长——群体中个体数目的增加。可以用重量、 体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，
所以常用群体生长来反映个体生长的状况） 个体生长个体繁殖 群体生长
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
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（3）平板涂布分离法（Spread Plate）
Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.