植物组织培养技术(国培)训练方案一、主要训练内容1. 组培实验室和组培工厂的设计；2. 母液的配制（大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机物）；3. 培养基的配制（配制流程、定容、调节PH值、分装、封口、灭菌）；4. 外植体灭菌(取材与处理、灭菌)；5. 无菌接种技术；6. 液体培养技术;7. 常见问题的处理（诱导培养、分化、增殖培养、生根培养等出现问题与解决措施）；8. 驯化移栽技术。

二、训练时间安排7月18日上午：1. 组织培养技术流程简介；2. 组培实验室和组培工厂的设计；3. 母液的配制；7月18日下午：4. 培养基的配制；7月19日上午：5. 外植体灭菌；7月19日下午：6. 无菌接种技术；7月20日上午：7. 液体培养技术;8. 常见问题的处理；7月20下午：9. 驯化移栽技术。

三、主要训练内容要点（一）植物组织培养技术流程简介植物组织培养是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。

通常我们所说的广义的组织培养，是指在无菌条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药组织、皮层、胚乳等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体（即外植体），培养在人工配制的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其长成完整的植株。

狭义概念：指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。

广义概念：无菌操作分离植物体一部分（即外植体）接种到培养基上，在人工条件下培养直至形成完整植株。

植物组织培养的理论基础是细胞全能性。

所谓细胞全能性是指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。

即：细胞具有形成完整植株的潜在能力，给其适宜的条件就能形成一个完整的植株。

特定条件：①不受母株控制的完整离体细胞；②特定的培养条件，包括营养、激素、光、温、气、湿等因子。

植物体愈伤组织脱分化再分化完整植株不定器官或体细胞胚1. 选择要培养的植物，查找相关资料，制定培养方案；2. 准备培养基以及相关器材、灭菌材料等；3. 外植体处理与灭菌---获得无菌材料；4. 初代培养（诱导培养）；5. 继代培养（增殖培养）或分化培养；6. 生根培养；7. 驯化移栽。

（二）实验室设计实验室设置的基本原则：科学、高效、经济和实用。

必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。

总体要求是保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。

实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的。

由洗涤室、准备室、接种室、培养室等组成。

需要明确1. 实验室建设目标；2. 主要功能；3. 需要购置的仪器设备；4. 驯化车间。

（三）母液的配制根据表分别配制MS各种母液：每种母液各种元素分别称取并分别溶解然后混合。

MS培养基母液的配制铁盐：分别溶解冷却后，将铁加入EDTA中，反之易沉淀。

各种母液的每种药品分别溶解后混合、定容。

（四）培养基的配制固体培养基是以琼脂做支持材料，90度以上溶解，40度下变成凝胶。

在凝固前加MS的各种母液及激素等，配成MS培养基。

方法步骤：（1）按做1升培养基计，先倒入2/3左右的水，加热，称取5、5克琼脂入锅加热熔解，近开锅时，加入称好的30克蔗糖、肌醇，待琼脂溶化后，加母液(不断搅拌，防止糊底)[在加热时量取母液，然后按表，用量筒移取大量元素母液20ml，钙盐20ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机物母液5ml【母液量取时先在容器中加入适量的纯净水，防治药品之间发生反应】。

]搅拌均匀——MS0{基本培养基}。

然后加激素[按下表添加]。

（2）培养基配好后，要调整pH值。

用0．1M的KOH、NaOH或HCl液调成5．8pH值左右。

在培养基配方不大变动的情况下可用经验法。

可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值。

调后注意一定要搅拌均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。

（3）分装30ml/瓶左右，封口并标记。

（4）灭菌（121度，20分钟）MS+BA0.3（月季初代培养专用，每人至少3瓶）MS+BA0.5+NAA0.1；MS+BA0.5+NAA0.2；MS+BA1.0+NAA0.1。

单位：mg/L(五)外植体灭菌（以月季为例）月季茎段材料的选取，保存、处理、灭菌流程，切割、接种。

选取开花近凋零的月季花枝（此时花下第3 节[具有5片小叶的叶片]的腋芽比较饱满，待萌发）或者腋芽饱满的枝条，放入干净的塑料袋中，迅速带回室内放入冰箱保存或直接处理。

去掉枝条上的叶片，剪成单芽茎段或5cm左右长，流水冲洗10min或者纯净水洗刷干净，进入超静工作台，先用70%酒精浸泡10-20秒，再用0.1%氯化汞灭菌7—8分钟（加1-2滴土温），无菌水冲洗5次，每次1分钟；切去两端伤口，上端平口，下端斜口，正放接种到预先配制的培养基上（MS+BA0.3），每瓶放一块材料（视情况最多放3块），放入培养室，光照培养。

（侧芽萌发1cm高后，能看到节间，即可接入生根培养基1/2MS+ NAA0.5，或进行增殖培养MS+BA1-2+NAA0.01-0.1，然后生根培养，根长0.5cm可以驯化移栽。

（六）无菌操作（接种）技术提前打开超静工作台（紫外灯、风机）15-20分钟。

(1) 洗净双手，换好实验服；(2) 上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。

然后擦拭工作台面；(3) 整理台面接种工具和用品等；(4)工具放入95%酒精中浸泡；(5)点燃酒精灯，灼烧接种工具；(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；(7)（强调：所有操作靠近酒精灯）（8）接种完毕后清理干净工作台；接种流程：先解开包口纸，将培养瓶几乎水平拿着，使瓶口靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动，使瓶口里外灼烧数秒钟。

然后用镊子夹取一块切好的外植体送人瓶内，轻轻插入培养基上。

接完种后，将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟。

封口，封口膜里面也要过火。

（七）液体培养技术培养基中不加固化剂（培养基的支撑材料，如琼脂、马铃薯、魔芋粉、卡拉胶等）的培养方法。

其他成分和培养基制备等完全与固体培养基相同。

优点：培养基的成分均匀，培养材料能充分接触和利用培养基中的养料，长势好、快，成本低。

缺点：不均匀，长势不一，交叉污染重，非静置培养时设备成本高等。

用途：用于增殖和生根时的培养【注：诱导培养一般用固体培养基】。

如马铃薯等快速增殖时可固体培养与液体培养交叉进行。

如：马铃薯液体浅层静置培养。

去掉顶芽和根基部，剪成大段5cm左右，大苗可剪成2段【根据试管苗的大小】，平放在培养基中。

放入培养架上静置培养。

（八）常见问题的处理1.组培苗观察的内容与方法2.观察培养物内部组织细胞变化通过化学试验和显微照相、镜检等手段，检查培养物的生长分化是否正常，有无变异等。

3.填写试管苗调查统计表4.针对培养过程中存在的问题提出解决措施。

组培苗观察记录与常见问题及解决措施初始培养阶段常见问题及调控措施增殖培养阶段常见问题及调控措施生根阶段常见问题及调控措施组培苗观察记录表-1（初代培养）接种人或小组： 外植体： 接种瓶数： 每瓶接种数： 接种时间： 诱导培养基： 分化培养基 增殖培养基生根培养基：组培苗观察记录表-2（增殖培养）接种人或小组： 外植体： 接种瓶数： 每瓶接种数： 接种时间： 诱导培养基： 分化培养基 增殖培养基生根培养基：组培苗观察记录表-3（生根培养）接种人或小组： 外植体： 接种瓶数： 每瓶接种数： 接种时间： 诱导培养基： 分化培养基 增殖培养基 生根培养基：（九）驯化移栽试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。

为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。

试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100％的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。

所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。

从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。

由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。

因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、逐步降低空气湿度等。

另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。

1．移栽用基质和容器适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、草炭、腐殖土等。

配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：2。

也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。

这些介质在使用前应高压灭菌。

或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。

要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。

以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。

(1)河砂河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。

（2）草炭土草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应。

（3）腐殖土腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。

一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。

第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。

（4）容器栽培容器可用6X 6Cm-10XlOcm的软塑料钵，也可用育苗盘。

前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用再移，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。

2．移栽前的练苗移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

3．移栽和幼苗的管理从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。

但要轻轻除去，应避免造成伤根。

栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要喷水成潮湿状态。

栽后喷洒杀菌剂，保证空气湿度达90％以上。

(1)保持小苗的水分供需平衡。