化学发光免疫分析
Chemiluminescence immunoassay (CLIA)
• 化学发光分析----根据化学发光反应在某一时刻的发光强 度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方 法，成为化学发光分析。
• 化学发光免疫分析----是集灵敏的化学发光技术和特异的 抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。
• 化学发光免疫分析的特点：灵敏度高、特异性高、分离简 便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。
化学发光免疫技术的类型
按发光剂不同分为
1. 发光酶免疫测定（Chemiluminescence enzyme immunpassay CLEIA）
2. 化学发光免疫测定技术（Chemiluminescence immunoassay CLIA）
活性。
酶1,促酶反促应反的应发的光发底物光底物
• 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物 • CLEIA中常用的酶有HRP和AP • HRP的发光底物有鲁米诺、对一羟基苯乙酸 • AP的发光底物有AMPPD、4—MUP（荧光底物） 特点：可做标记物，也可以做过氧化物酶的底物
1.鲁鲁米米诺诺
对一羟基苯乙酸（HPA）
进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化 学发光的现象. 它包含了电化学和化学发光两个过程.
ECL和CL的区别在于:ECL是电启动发光反应,而CL是通 过化合物混合启动发光反应,因此ECL反应便于精确控制, 具有灵活性.
电化学发光剂
三联吡啶钌的特点
ECL分析中采用三联吡啶钌作为标记物，其活化衍生物是 三联吡啶钌+N羟基琥珀酸胺脂（NHS），该衍生物具有水 溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定， 而且避免了本底噪声的干扰。
三丙胺(tripropylamine,TPA)
氧化
.+
CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3 CH3CH2CH2-N-CH2CH2CH3
电极 CH2CH2CH3
+ e-
CH2CH2CH3
Ru(bpy)33+ 还原
Ru(bpy)32+
+Ru(bpy)32+
..
CH3CH2CH2-N-C-CH2CH3
• 二价的三联吡啶钌在电场的作用下，失去一个电子氧化成 三价的三联吡啶钌
• 同时，在电场的作用下，三丙胺也失去一个电子被氧化, 然后脱氢成三丙胺自由基
• 三丙胺自由基传递一个电子给三价的三联吡啶钌使之进入 激发态
• 激发态的三联吡啶钌不稳定,以发射一个波长为620nm的光 子的形式释放能量而回到基态三联吡啶钌不被消耗,即发 光标记物可循环发光
• HPA在H2O2存在下被ＨPR氧化成氧化二聚体（荧光物质），在 350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度 计计量。
一，发光酶免疫测定（CLEIA）
• 原理 属于酶免疫测定的一种，只是最后一步酶 反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光 在特定的仪器上进行测定。
• 技术类型 根据酶促反应所用底物不同可分为： 1 荧光酶免疫测定技术 2 化学发光酶免疫测定技术
免疫学检测的发展阶段
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应 进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、 酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显 示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。 我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程:
中国免疫学检测的历史演进
• 放射免疫检测：兴于20世纪70年代，现在已经基 本淘汰，可能有些小医院还在使用。
免疫分析法
它是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一 种技术手段。
抗原抗体反应是指抗原与相ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的抗体之间发生的 特异性反应，它既可以发生在体内，也可以发生 在体外。
免疫标记技术是将一些既容易测定又具有高度敏 感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通 过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中 抗原或抗体的性质或含量。
注:试剂表现不仅仅表现在灵敏度和宽线性,还有特异性,
重现性,线性回归,携带率,准确性和临床符合性等多种表现
ECL的临床应用
肝炎 乙肝表面抗原 乙肝表面抗体 乙肝核心抗体 乙肝核心抗体M 乙肝e抗原 乙肝e抗体
甲状腺功能 三碘甲状腺原氨酸 甲状腺素 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺素 超敏促甲状腺素 甲状腺摄取 甲状腺球蛋白 抗-TPO 抗-Tg
3. 电化学发光免疫测定技术 （Electrocheminluminescence immunoassay ECLI）
按分离方法不同分
1. 微离子化学发光免疫测定 2. 磁颗粒化学发光免疫测定
化学发光剂
• 机制 某些化合物可以利用化学反应产生能量使其产物
分子或反应中间态分子上升至电子激发态，当此产物分子 或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量 （即发光）。
心血管急诊 肌酸激酶同工酶 心肌钙蛋白-T 心肌红蛋白 Pre-BNP 地高辛 洋地黄
2. 微粒子捕获法 采用无磁性的微粒子作为抗原抗体的包 被载体，然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合和游离 状态的分离。
3. 包被珠分离法 用聚苯乙烯等材料制成用作包被抗原抗 体的小珠，经抗原抗体反应后，将结合状态和游离状态 的酶标记物分离。
二.化学发光免疫测定技术(ELIA)
• 原理 用发光剂直接标记抗原或抗体，与待测样本中相应 的抗体或抗原、磁性颗粒上的抗原或抗体反应，通过磁场 把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物 分离开来，然后加入发光促进剂进行发光发应。
按测定物反应体系的物理状态分
匀相免疫测定 非匀相免疫测定
发光的分类
光照发光：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当 回复至基态时发出较长波长的可见光。
生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能， 生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能 量以光子的形式放出。
化学发光：在常温下由化学反应产生的光的发射，化学发 光是一个多步骤的过程。
根据免疫学反应模式分 1 双抗体夹心法和双抗原夹心法 2 固相抗原竞争法
化学发光酶免疫测定技术反应原理图
发光酶免疫测定技术的技术要点
1. 抗原抗体结合反应 将已包被了抗体的乳胶颗粒和待 测标本加入反应杯中，经温育一定时间后，再加入AP标 记抗体，温育，形成固相包被抗原—抗体—酶标记复合 物。
2. 分离技术 将复合物转移到玻璃纤维上，用缓冲液洗 涤，没结合的抗原被洗脱，酶标抗体-抗原-胶乳微粒抗 体复合物被保留在纤维膜上。
• 技术类型 1 分离方法 常用磁颗粒分离技术 2 免疫学反应模式同酶发光免疫测定技术，不同的只是相 应的标记物是吖啶脂而不是酶。
磁性微粒子固相
直径2.8微米
亲和素—生物素
亲和素—生物素
三,电化学发光免疫测定技术(CLIA)
• 电化学发光(ECL) 原理 是指在电极上施加一定波形的电压或电流信号,
+H+
H CH2CH2CH3
氧化
CH3CH2CH2-N-H
+ CH3CH2CHO CH2CH2CH3
ECL的测定模式
ECL的优势
• 灵敏度高(10-12~10-18)，可达Pg/ml或Pmol水平 • 重复性好 CV＜5.0% • 检测线性宽(7个数量级) • 试剂稳定，无污染，有效期长 • 操作简单，易于自动化
肿瘤标志物 甲胎蛋白 癌胚抗原 糖类抗原12-5 糖类抗原15-3 糖类抗原19-9 糖类抗原72-4 游离前列腺特异性抗原 前列腺特异性抗原 Cyfra21-1 烯醇化酶
代谢 铁蛋白 B12 叶酸 胰岛素 免疫球蛋白E
生殖/内分泌 人绒毛膜促性腺激素 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 睾酮 催乳素 可的松 硫酸脱氢表雄酮
3. 酶促发光反应 加入4-MUP，酶标抗体上的AP将4-MUP 分解，形成4-MU，它在360nm激发光照射下发出448nm的 荧光，经光记录仪放大处理计算出待测物质的含量。
分离技术
1. 磁颗粒分离法 原理为血清样品与标准品中的抗原或抗 体与磁颗粒上的一定量的抗体或抗原反应，产生的抗原 抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分 与游离部分分离。
• 化学发光剂或发光底物 在化学发光反应中参与
能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。
• 发光剂分为荧光素、生物发光剂和化学发光剂。
化学发光剂应符合以下几个条件
① 能参与化学反应； ② 与抗原或抗体偶联后成稳定的结合物试剂； ③ 偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④ 应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫
• 酶联免疫检测：兴于20世纪80年代，现普遍使用 于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方 法。
• 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技 术，始于20世纪90年代，现广泛应用于县级以上 各医疗机构，产品已经步入成熟期。
免疫分析检测的技术分类
•按示按踪示物踪及物标及记标种记类种分类分
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术
在自然界有各种各样的发光现象
萤火发虫发光光萤火虫
深海鱼发光
化学发光
Chemiluminescence （CL）
• 化学发光是指在某些特殊的化学反应中， 反应的中间体或产物由于吸收了反应释放 的化学能而处于电子激发态，当其回到基 态时伴随产生的光辐射现象。
化学发光反应 包括两个关键 的步骤：化学 激发和发光
电化电化学学发发光光免免疫疫分分析析法法
ElectErole-ctCro-hCehemmiilulummineisnceenscecence ImmImumnuonoaassssayay(EC(LEI) CLI)
主讲人 崔天根