52 诊断酶学一、概述（一）酶的组成、结构与功能1.酶的本质和特征⑴酶的化学本质：绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白组成的复合体，极少数酶是核酸。

⑵酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外，还具有极高的催化效率、高度的特异性（specificity）及催化作用的可调节性等特点。

⑶由酶所催化的反应称为酶促反应。

⑷核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸。

（二）酶的催化作用机制1.酶活性中心是酶分子执行催化功能部位酶分子中能和底物特异结合并将底物转化为产物的区域称为酶的活性中心（active center），酶活性中心是由空间上彼此靠近的化学基团组成的具有特定空间结构的区域。

2.酶反应的诱导契合学说（induced fit hypothesis）在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-底物中间复合物（ES）。

在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为诱导契合学说。

（三）酶的分类与编号1. 根据酶所催化反应类型可将酶分为六大类，即：氧化还原酶类（oxidoreductases）转移酶类（transferases）水解酶类（hydrolases）裂解酶类（或裂合酶类）（lyases）异构酶类（isomerases）合成酶类〔synthetases或连接酶类(ligases）〕2. 国际酶学委员会将每种酶用4个数字加以系统编号。

数字前冠以EC，数字之间用黑点隔开。

第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个表示酶的编号序数。

(四)同工酶的概念与特征同工酶是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。

同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。

(五)工具酶参与的指示反应通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。

常用工具酶多为氧化还原酶类。

在临床生化检验中，许多项目的测定均有工具酶参与，最常用的有两类分光光度法：一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（H2O2），再加氧化发色剂比色；另一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量。

附：酶循环法酶循环法（enzymatic cycling methods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。

目前临床上已应用于总胆汁酸、HCY的测定。

（六）代谢物浓度的酶法测定技术1.终点法在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。

(1)直接法：如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析.(2)酶偶联法：如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的，即为酶偶联法。

2. 动力学法根据米氏方程，当[S]<<Km，一般[S]/Km<0.2，最好<0.05，[S]+Km≈Km，此时呈一级反应，反应初速度v=k[S]。

如果能准确测定反应的初速度（v），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。

二酶测定技术(一)、定时法测定酶活性定时法是根据固定时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶活性，这是早期测定酶活性浓度的方法。

用定时法准确测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，避开延滞期和一级反应。

(二)连续监测法测定酶活性连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。

1.直接法在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度等计算出酶活性浓度。

只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。

2.间接法采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。

反应。

(三)干扰因素1. 其他酶和物质的干扰2. 酶的污染3. 非酶反应4. 分析容器的污染5. 沉淀形成(四)血清酶活性浓度测定的条件的优化测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大。

主要与下述一些因素有关：①如底物、辅因子、活化剂、缓冲液和变构剂种类和浓度；②指示酶和辅助酶的种类和浓度；③反应混合液的pH和离子强度；④其他可变因素，如已知抑制剂的去除。

1.方法选择尽可能采用连续监测法；尽量减少操作步骤。

2.仪器和设备明确规定仪器和设备的各种性能规范。

3.试剂化学试剂必须具有一定纯度；试验用水最好是纯水或双蒸水。

4.自动生化分析仪参数的设置（1）方法类型终点法或连续监测法。

反应方向分正向/向上/+（吸光度增加）或负向/向下/-（吸光度减低）。

（2）波长选择酶促反应体系吸光度最大的波长（3）样品量与试剂量应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。

一般推荐样品与试剂体积比为1:10。

（4）稀释水量（5）反应时间线性反应时间范围愈宽者，愈适于临床应用。

（6）孵育时间（7）延迟时间（8）监测时间酶活性测定的连续监测法至少90~120s或至少4点（3个），少于3个不能称为连续监测法，因为不能计算线性度（不知是否为线性反应）。

（9）试剂吸光度上、下限（10）底物耗尽限额（11）线性度（12）试剂空白速率（13）线性范围按试剂质量而设置，超过范围应增加样品量或稀释后重测。

（14）计算因子F值（或系数K）(五)部分分析前因素对酶活性测定的干扰1. 溶血部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外（如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、己糖激酶等），少量血细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。

2. 抗凝剂草酸盐、柠檬酸盐和EDTA等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5’-NT；草酸盐既可与丙酮酸或乳酸发生竞争性抑制，又能与LD及NADH或NAD+形成复合物，从而抑制催化的还原或氧化反应。

柠檬酸盐、草酸盐对CP、ChE均有抑制作用。

3. 标本储存温度大部分酶在低温中可稳定较长时间，标本如在离体后不能及时测定，应及时分离血清或血浆并置冰箱冷藏。

(六)酶活性浓度的单位1.酶活性单位（1）惯用单位（2）国际单位（3）Katal单位1979年国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的反应速率相一致，推荐用Katal单位（也称催量，可简写为Kat）。

即在规定条件下，每s时间内催化转化1摩尔底物的酶量，1katal=1mol·s-1。

我国法定计量单位制中的酶催化活性单位为katal，其对血清中酶量而言显然过大，故常用单位为μkatal或nkatal。

1katal=60×106U，1U=1μmol·min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal。

2.酶活性浓度单位临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。

酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。

（1）表示方法目前在临床化学中，各国学者几乎都习惯用U/L来表示体液中酶催化浓度。

1U/L=16.67nkatal/L。

（2）酶活性浓度单位的计算用连续监测法进行酶活性测定时，不需作标准管或标准曲线，根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。

摩尔吸光系数（ε）的定义为：在特定条件下，一定波长的光，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00 mol/L时的吸光度。

3.参考区间和正常上限倍数的应用（1）参考区间由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同，加之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之间所得参考区间差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自己的参考区间。

表5-4列举了几种临床常用酶的成人参考区间。

（2）正常上限倍数的应用正常上限倍数是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。

在分析酶学报告时，除传统测定的报告方式（U/L）外，也提倡用正常上限（upper limits of normal, ULN）倍数作为酶活性浓度的表示法。

临床常用血清酶的测定方法与参考区间（37℃）(七)系数K值的计算与应用在实际工作中，特别是用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲V、v和L均为固定值，ε为常数，K为酶活性浓度定量系数（或称为常数），主要用于临床酶活性测定的计算与校准。

1.系数K值的意义与设置系数K值对于酶的测定十分重要，过高虽然测定的线性较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但检测线性窄。

K值的设置应考虑测定酶的参考范围上限及测定时间两方面，以保证测定结果的可靠。

2.系数K值的类型与计算系数K值只能供用户通过计算式及求实测K值时参考，不能直接用于酶活性浓度的计算。

常用指示物的摩尔消光系数（cm2·mol-1）与用途指示物主波长 次波长 用途 NADH ε340nm 6.22×103 ε380nm 1.33×103测ALT 、AST 、LD 、α-HBD 等 NADPH ε340nm 6.22×103 ε380nm 1.33×103测G6PD 、CK对硝基苯酚 ε405nm 18.5×103 ε476nm 0.20×103测ALP 对硝基苯胺ε405nm 9.9×103测γ-GT 5-硫代-2-硝基苯甲酸 ε405nm 13.6×103 ε476nm 2.80×103测ChE（八）、酶质量测定1、免疫化学法测定酶质量原理利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体，然后以免疫学方法测定酶蛋白质量。

质量单位多以ng/ml 、μg/L 来表示。

（1）.放射免疫测定（RIA ） 分为直接法与间接法。

直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。

（2）.其他方法 主要有免疫抑制法、化学发光免疫测定（CLIA ）、酶免疫测定（EIA ）、荧光酶免疫测定（FEIA ）等。

国内曾有用免疫沉淀法（单向扩散法）测定酶活性的报告，如超氧化物歧化酶（SOD ）测定。

2、酶质量免疫化学测定法的优缺点与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有： ①灵敏度高，能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；②特异性高，几乎不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等 的影响；③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；④特别适用于同工酶的测定。