activechemo therapeu ticregi m en .A nn O nco l ,2001;12(6)∶7210　Cham bars JT ,R u therfo rd TJ ,Schw artz PE ,et a l .A p ilo t studay of topo tecan fo r the treatm en t of the serou s endom etrial cancer .P roc AmSoc C linO nco l ,2001;20∶21911　H all JB ,H iggin s RV ,N aum ann RW ,et a l .Phasestudy of topo tecan and cisp latinum stages and o r fo r recu rren t endom etrial cancer .P roc Am SocC lin O nco l ,2000;19∶40912　梁利波,马业伟,周小山,等.特异启动子调控的M DR 1和M nSOD 基因对骨髓的选择性保护作用.中华肿瘤杂志,2003;25(1)∶1713　W alter N G ,Bu rke JM .T he hairp in ribozym e :stuctu re ,assem b ly and catalysis.Cu rr Op in Chem B i o l ,1998;2(1)∶2414　Kaneta Y ,T sukazak i K ,Kubu sh iro K ,et a l .Selective cyto tox ity of adriam ycin i m m unocon jugate of monoclonal an tibody M SN 21to endom etrial adenocarcinom a in vitro and in vivo .O nco l R ep ,2000;7(5)∶10615　U ral AU ,T akedbe N ,A dh ikari D ,et a l .Genetheraphy fo r endom etrial carcinom a w ith the herpessi m p lex thym idine k inase gene .Gynoco l O nco l ,2000;76(3)∶10(收稿:2003205227)结核病病原学研究进展西安市结核病胸部肿瘤医院(西安710061)　党丽云　宋栓保 近年来,结核病疫情在世界范围内有回升趋势,是危害人类健康的主要传染病。

结核病特点:临床疗效差、慢性迁延不愈、易复发、恶化。

随着细胞免疫学、分子生物学及分析微生物学的发展,对结核病病原学的研究有了新的发现,认为结核病难治的主要原因之一为结核分支杆菌的变异,包括:耐药性变异、毒力变异、L 型变异及休眠菌形成等。

现简述如下。

1　结核分支杆菌基因研究进展1.1　结核分支杆菌基因组　1998年全国第一个结核分支杆菌标准株H 37R v 的全基因图谱完成是结核病研究的重要进展[1]。

H 37R v 基因组包含4411529个碱基对,包括4411个基因,有潜在编码能力的基因约3977个,约占90.2%,G +C 含量较高,有研究者指出[2]结核分支杆菌基因上至少有8个来自人的基因,而这些基因编码的蛋白质协助结核杆菌逃避宿主的防御系统。

1.2　结核分支杆菌毒力相关基因　结核分支杆菌毒力对结核病发病、流行和预防有重要影响。

有学者对临床分离出的人型结核杆菌,用豚鼠作动物模型检测结核杆菌的毒力。

结果:强、中毒力菌株占92.6%,弱毒力菌株仅7.4%。

一条强毒力结核杆菌的致病能力是弱毒菌的200倍。

研究表明与结核分支杆菌毒力相关的因子有:索状因子、硫脂质、氧合结核环脂酸[3]等。

结核杆菌毒力的强弱与毒力相关基因的表达有相当大关系。

目前研究表明有关结核分支杆菌毒力相关基因有:erp 、rpov 、tlyA 、KatG 、V irs 、SigF 。

研究毒力相关基因的方法是以基因组DNA 序列与mRNA 为对象,比较分析结核分支杆菌有毒菌株与无毒(或弱毒)菌株之间的差异,从中找出两者的差异点为试验材料。

但差异不一定与毒力有关,最终还需要通过基因分析方法及毒力相关基因鉴定方法验证,以确定这些差异的基因是否与毒力有关。

1.3　结核分支杆菌休眠菌基因　D em ai 用RNA 酶保护测定发现在牛结核分支杆菌培养的对数期无SigF 的mRNA 出现,在对数期后、氧化应激、无氧和酒精性休克时少量表达,但在稳定期、氮耗竭期冷休克时则大量表达,由此作者认为Sig F 在结核分支杆菌适应休眠状态和抵抗宿主防御反应中起一定作用。

氧化应激时Sig F 少量表达,那么结核分支杆菌如何抵抗有毒氧代谢产物的作用呢?Sherm a 等发现给予有毒氧代谢产物刺激后结核杆菌KatG 2mRNA 表达增加,产生一种蛋白质KatG 。

L i 等[4]发现将有毒株结核菌H 37R v 的KatG 基因转入无KatG 基因对异烟肼耐药的结核分子杆菌H 37R v I N H r核内,可恢复后者产生触酶2过氧化物酶的能力,而触酶2过氧化物酶可以分解有毒氧代谢物,由此可见KatG 基因对结核分支杆菌在细胞内的持续存在起着重要作用。

结核分支杆菌进入巨噬细胞后是否有特殊的基因表达以适应细胞内环境?研究发现PE 2PGR S 基因的表达参与巨噬细胞内结核分支杆菌的活性。

当PE 2PGR S 基因发生突变,巨噬细胞内休眠状态的结核分支杆菌生存时间缩短。

2　结核分支杆菌耐药性研究　自20世纪90年代初以后,对结核分支杆菌耐药机制的研究已深入到分子水平。

目前几种主要化疗药物耐药性分子机制已得到初步阐明,都涉及到相关基因的突变,其中涉及利福平耐药性101陕西医学杂志2003年11月第32卷第11期本页已使用福昕阅读器进行编辑。

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基因为RNA聚合酶Β亚单位基因(ropB基因)。

96%利福平耐药菌株编码RNA聚合酶Β亚单位ropB基因81bp 区域发生突变,碱基插入或缺失,使利福平与RNA聚合酶亲和力明显减少,导致耐药。

已知利福平耐药菌的ropB 基因有14种突变,其中9种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药。

有学者研究发现[5]:利福平与利福喷丁两药均耐药符合率为97.8%,说明两药完全交叉性耐药。

异烟肼耐药性基因为过氧化氢2过氧化物酶基因(KatG基因)异烟肼靶蛋白基因(inhA基因)和氧化防御基因(ahpC基因)。

em bB基因编码阿拉伯糖的转移酶是乙胺丁醇的推测靶位,其变化与乙胺丁醇的高耐药性有关。

喹诺酮类药的耐药性与螺旋酶A亚单位基因(gyrA)突变有关。

尼克酰胺酶基因(pnc A基因)的突变涉及结核分支杆菌对吡嗪酰胺的耐药性。

链霉素耐药是由于核糖体亚基突变,主要突变部位是编码核糖体蛋白S12的rp s L基因。

研究认为,结核分支杆菌多重耐药分子机制是相应基因突变的累积造成的。

目前对耐多药结核菌的检测,除经典细菌培养和改良的快速培养药敏的方法外,分子药敏试验发展较快,使耐多药结核病快速、准确诊断成为可能。

方法有:①DNA测序分析:是检测DNA分子差异最可靠的方法,但需特殊仪器,目前常规实验室难以普及。

②基因芯片技术:从理论上讲,可将结核分支杆菌所有有意义的基因突变部位以探针形式做在芯片上,达到快速检测多药物敏感试验的目的,但芯片技术需昂贵仪器实验成本高,使该技术的普及暂时受到限制。

目前仅对ropB基因突变检测。

有学者[6]报告:与DNA测序结果进行对比,芯片技术对ropB基因突变检测的敏感性为85%;③聚合酶链反应2单链构象多态性分析(PCR2SSCP法):文献报告用PCR2SSCP法对耐药株KatG突变检测与DNA测序对照,敏感性为95%,特异性为100%,对耐药株ropB基因突变检测与培养药敏试验对照,敏感性为95%,特异性为100%[7]。

④噬菌体荧光素检测器快速药敏试验:该方法不需事先知道耐药机制,是一种很有前途的快速药敏表型试验,文献报告[8]该方法对利福平耐药情况的检测结果与罗氏培养基结果一致,但时间缩短仅为72h。

3　结核分支杆菌L型突变　所谓L型是指细菌发生细胞壁缺陷的变异型。

首次在英国L ister医学研究所发现,因此命名为“L型”。

结核分支杆菌感染后可因抗痨药作用于细胞壁或体内的溶菌酶、抗体等影响引起细胞壁缺损使之成为L型。

结核分支杆菌变为L型后,失去了原菌形态,具有高度变形性,表现为原生小体、圆球体、巨形体、长丝体等,且形态具有可塑性、滤过性和溶解性,因此L型菌能通过原菌难以通过的生物膜,如血脑屏障、胎盘屏障等,引起相应的疾病。

L型结核杆菌毒力减弱,致病性减少,但可在宿主体内长期潜伏存在,使疾病慢性化。

同时在诱因去除的情况下能回复细菌原型,导致疾病复发。

关于结核分支杆菌L型病原学检测,由于其细胞壁不同程度的缺陷,经典抗酸染色阳性率极低,有学者主张用改良抗酸染色(IK法)可提高阳性率。

用IK法对肺结核患者的痰标本进行检测,结核杆菌L型检出率为34.3%,明显高于经典抗酸染色法的4.9%[9],对病理证实的结核病和非特异性淋巴组织中结核分支杆菌L型检测的阳性率分别为80%、67%[10]。

结核分支杆菌L型的培养,以往认为L型菌缺乏细胞壁、菌体内渗透压在等渗的普通培养基上容易破坏,需要加入渗透压稳定剂和血清的高渗透压培养基上方能生长。

最常用的是胰胨大豆蛋白胨琼脂培养基(T SA2L)。

但有学者[11]认为在宿主体内,长期潜伏存在的细菌稳定L型,由于生长繁殖缓慢和适应了宿主非高渗透压或生理渗透压的环境,以致在高渗透压L型固体培养基上难以生长。

可用非高渗透压液体培养基培养,且用其有效检出并获得了结核分支杆菌稳定L型纯培养物。

也有学者[12]指出溶血离心培养检测L型结核分支杆菌提高了血液标本中L型的检出率。

4　结核分支杆菌休眠菌　结核分支杆菌感染人体后约10%感染者可发生结核病,绝大多数结核菌以休眠菌形式存在于机体内,当机体免疫力降低时,结核休眠菌又开始生长繁殖导致疾病,即结核休眠菌是残存在人体单核巨噬细胞内极微量处于代谢静止的结核菌。

4.1　结核休眠菌的生物学特性　随着结核杆菌进入休眠状态,结核杆菌的酶、蛋白质等生物学特性也随之改变,表现为触酶、过氧化物岐化酶、乙酰辅酶A羧化酶等酶的活性明显降低;与细胞壁及纤维多糖结构有关的16kD a小热休克蛋白高度表达。

细胞壁增厚、结核杆菌的平均长度从2.23Λm增至2.94Λm。

4.2　结核休眠菌逃避巨噬细胞杀灭机制4.2.1　选择特殊受体抑制巨噬细胞的活化　病原体通过宿主吞噬细胞表面的不同受体进入吞噬细胞,启动相应的信息传导机制而被杀灭。