第21卷第2期极地研究Vol.21,No.2 2009年6月CH I N ESE JOURNAL OF P OLAR RESE ARCH June2009研究论文影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解率的环境因素研究刘芳明1,2 缪锦来1,2 臧家业1 董春霞3 王以斌1,2 (1国家海洋局第一海洋研究所,青岛266061;2海洋生物活性物质国家海洋局重点实验室,青岛266061;3颐中(青岛)实业有限公司,青岛266021)提要 以柴油为唯一碳源和能源,从南极海水海冰微生物资源库中筛选到一株石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49,并对影响其生长和降解率的环境因素(pH、温度、盐度、营养盐和表面活性剂)进行了初步研究。
结果表明:希瓦氏菌可作为低温海域石油烃污染生物修复的菌源,其生长和降解的最适条件为:初始pH7.5,温度15℃,盐度6%,摇瓶装量80m l,最佳氮源硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物,添加表面活性剂可促进希瓦氏菌NJ49的生长和生物降解率。
关键词 南极海洋 低温降解菌 柴油 生物降解 环境因素0 引言随着海上石油开采、运输和各类交通活动的日益频繁,海洋中石油烃污染物逐渐增多,而大规模溢油事件也时有发生,给海洋生态及近岸环境造成严重危害,由于自然微生物的生物修复是清除海洋石油烃污染的一种重要机制[1],因此备受关注。
国内研究者对海洋中温降解菌的生物降解曾进行了广泛研究[2—4],但对低温环境中石油烃降解研究较少。
南极低温微生物资源丰富,从中获取低温降解菌成为新的研究热点,国外学者已从南极海洋中分离筛选得到不同种属的降解细菌,如Ha lo m onas[5]、R hodococcus[6]和Sphin2 go m onas[7],有的降解菌可以在4℃条件下降解烷烃[8],甚至在更低的温度条件下降解多环芳烃[9],为低温环境石油烃污染修复提供了新的思路。
柴油是一种复杂的蒸馏混合物,内含碳原子数为C9—C20范围的石油烃,因此是研[收稿日期] 2008年11月收到来稿,2009年2月收到修改稿。
[基金项目] 国家自然科学基金项目(40876107)资助。
[作者简介] 刘芳明,男,1978年出生。
实习研究员,主要从事海洋环境污染、监测与修复研究。
28极地研究第21卷究碳氢化合物生物降解的优良底物[10]。
本研究以市售柴油为唯一碳源和能源,从南极微生物资源库中筛选低温降解石油烃的细菌,并对影响其生长和石油降解率的环境因子进行研究,以期为低温海域石油烃污染的生物修复提供基础资料。
1 材料与方法1.1 细菌样品所用样品于2001年11月—2002年3月中国第18次南极科学考察期间采集,并分离纯化得到,共50个,菌株编号分别为NJ29—NJ60,NJ280—NJ297。
1.2 培养基1.2.1 2216E液体培养基酵母粉,1g;蛋白胨,5g;磷酸铁0.1g;过滤海水,1000mL;pH,7.0—7.5。
1.2.2 2216E固体培养基在上述液体培养基中加1.5%琼脂即可。
1.2.3 筛选、发酵用无机盐培养基(MMC)NaCl,24g;MgS O4・7H2O,7.0g;NH4NO3,1.0g;KCl,0.7g;KH2P O4,2.0g; Na2HP O4,3.0g;蒸馏水,1000mL;pH7.4。
灭菌后补以适量柴油,摇匀。
1.2.4 MMC固体培养基MMC液体培养基加1.5%琼脂,灭菌并待培养基凝固后,用移液枪吸取适量柴油,涂布均匀。
以上培养基灭菌条件均为121℃湿热灭菌20m in。
试剂均为分析纯;海水取自胶州湾,经沉淀灭菌后备用;柴油为市售0号柴油,经0.22μm滤膜过滤灭菌后备用。
1.3 南极低温降解菌的筛选将斜面培养基上保存的南极细菌活化后,菌液以5%接种量接至2216E液体培养基中,培养7d后从培养液中移取1mL培养液,转接到添加柴油的2216E液体培养基中,连续驯化培养3次后,取1mL培养液到MMC液体培养基中。
以不接种的MMC做空白对照,置低温摇床培养箱,8℃,120r/m in条件下,振荡培养15d。
挑取摇瓶中显现浑浊的样品,吸取样品液0.1mL,在无菌操作条件下,涂布于MMC琼脂平板,置恒温培养箱中8℃下培养7d。
能够在MMC琼脂平板上生长的细菌,被视为南极石油烃低温降解菌。
1.4 南极低温降解菌NJ49生长曲线的测定移取5.0mL活化的南极低温降解菌NJ49菌液,加入装有100mL以柴油为唯一碳源的MMC液体培养基三角烧瓶中,于15℃,120r/m in振荡培养,每隔24h取样;以未接菌的MMC液体培养基做空白,光电比浊法[11]测540n m处的吸光值(OD)。
以培养时540nm间为横坐标,吸光值为纵坐标作图,得出菌株在该条件下的生长曲线。
1.5 环境因子影响的实验测定1.5.1 pH对NJ49降解率影响的测定用1mol/L HCl或1mol/L Na OH调节2216E液体培养基的pH值依次至5、6、7、8、9和10,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。
降解率计算参照文献[12]。
1.5.2 温度对NJ49降解率影响的测定将MMC 液体培养基的pH 值调节为7.5,分别接种,设温度依次为0、10、15、20、30和35℃,南极低温降解菌NJ49发酵培养,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.3 盐度对NJ49降解率影响的测定用NaCl 溶液调节MMC 液体培养基的盐度依次至4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%和9.0%,分别接种NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.4 通气量对NJ49降解率影响的测定在6只250mL 摇瓶中分别装入20、50、80、100、120和150mL MMC 培养基,培养基的pH 值调节为7.5,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540n m 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.5 氮源对NJ49降解率影响的测定选取硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、尿素作为氮源,其浓度均为1.0g/L,接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.5.6 磷源对NJ49降解率影响的测定选取磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾+磷酸氢二钾做为磷源,其浓度均为0.1g/L,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250n m 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
1.6 表面活性剂对南极低温降解菌NJ49降解率影响的测定在MMC 液体培养基中分别加入十六烷基三甲基溴化铵(CT AB )、十二烷基磺酸钠(S DS )、鼠李糖脂、鼠李糖脂+S DS,其浓度均为100mg/L,分别接种南极低温降解菌NJ49,于15℃,120r/m in 培养至对数生长期,取样,分别于250nm 和540nm 处测定吸光值,并计算降解率。
2 结果与分析2.1 南极低温降解菌的筛选经过3次的驯化培养和15d 的筛选培养后,发现所有样品中有4个摇瓶里的培养液变得浑浊,表明经过驯化培养后,4株南极细菌,即NJ41、NJ44、NJ49、NJ289,能以柴油为唯一碳源和能源在低温(8℃)进行生长,其中NJ49生长态势最好,见图1。
通过16S r RNA 分子鉴定,已确定NJ49属于希瓦氏菌属(数据未发表),NCB I Gene Bank 序列号为EU788041。
后续实验以希瓦氏菌NJ49为研究对象。
2.2 希瓦氏菌NJ49的生长曲线测定南极低温降解菌NJ49的生长曲线,从图2可以看出,培养4d 后NJ49达到稳定期,此时南极低温降解菌NJ49细胞数量达到最高峰,生长与死亡处于一个动态平衡中。
38第2期 刘芳明等:影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解……第8d 后,由于培养基中的营养基本被消耗,生长速率小于死亡速率,细菌数量开始减少,进入衰亡期。
图1 MMC 培养基中的南极细菌NJ49.左:空白对照,右:MMC 培养基Fig .1.Antarctic bacteria NJ49in MMC culture .Left:contr ol,R ight:MMC图2 希瓦氏菌NJ49的生长曲线Fig .2.The gr owth curve of Antarctic cold 2adap ted degrading bacteria She w anell s p.NJ492.3 培养基初始pH 值对希瓦氏菌NJ49降解率的影响培养基的初始pH 值对希瓦氏菌NJ49生长和降解的影响见图3。
可以看出,在pH 5—10培养基条件下,菌株NJ49都能生长和降解;在pH 7—8培养基条件下,菌株生长和降解处于最高状态。
图3 培养基初始pH 对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响Fig .3.Effects of culture initial pH on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency48极地研究第21卷2.4 温度对希瓦氏菌NJ49降解率的影响希瓦氏菌NJ49在15℃时生长量和降解率均达到最高,见图4。
随着温度的增加其降解率开始下降。
在0—25℃时,希瓦氏菌NJ49菌株可以生长并对柴油进行降解,但超过25℃,菌株生长非常缓慢,30℃时已经停止生长。
希瓦氏菌NJ49在0—5℃的低温条件下,可以对柴油进行降解,一般情况下在此低温范围,中温降解菌代谢活性非常低,生长缓慢。
图4 培养温度对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响Fig .4.Effects of different te mperture on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency2.5 盐度对希瓦氏菌NJ49降解率的影响希瓦氏菌NJ49在4%—9%盐度范围内均能生长和降解柴油,在6%盐度下,生长和降解达到最高。
随着盐度的增加,其生长和降解受到限制,见图5。
图5 盐度对希瓦氏菌NJ49生长和降解率的影响Fig .5.Effects of different salinity on She w anell s p.NJ49gr owth and degradati on efficiency2.6 通气量对希瓦氏菌NJ49降解率的影响在250mL 摇瓶中装入50—120mL 培养基时,菌株希瓦氏菌NJ49生长和降解量均处于较高的状态;当装量为80mL 时,希瓦氏菌NJ49生长最好,降解率也最高,但随着培养基含量超过120mL,其生长和降解量则大幅度下降,见图6。