四川大学华西第二医院国家药品临床试验机构Ⅰ期临床研究室实验室四川大学华西药学院临床药学教研室生物样本分析方法的建立和确证、未知样品测定及其质量控制技术指导原则第一版（仅供内部参考）制定： 复核： 签发：二○○五年十二月目 录1. 常用分析方法(Common Technique) (3)2. 方法建立前的准备(Pre-methods Preparation) (3)2.1. 文献资料的查阅与接收(Literature Preparation) (3)2.2. 试验用参比纯品的准备(Reference Standard Preparation) (4)2.3. 仪器、试剂的准备(Apparatus and Regents Preparation) (4)2.4. 工作量及试验人员的准备(Workload and Personnel Preparation) (4)2.5. 课题经费预算(Outlay budget) (5)3. 方法确证的分类(Classification of Validation) (5)3.1. 完整确证(Full Validation) (5)3.2. 部分确证(Partial Validation) (5)3.3. 交叉确证(Cross Validation) (6)4. 分析方法的建立与确证（Method Development and Validation） (6)4.1. 特异性(Specificity) (6)4.2. 准确度、精密度与回收率(Accuracy, Precision and Recovery) (7)4.3. 标准曲线（Calibration / Standard Curve） (7)4.3.1. 最低定量限(Lower Limit of Quantification (LLOQ)) (8)4.3.2. 标准曲线样品浓度与响应值之间的关系(Calibration Curve/StandardCurve/Concentration-Response) (8)4.4. 稳定性(Stability) (8)4.4.1. 冻融稳定性(Freeze and Thaw Stability) (9)4.4.2. 室温条件下稳定性(Short-Term Temperature Stability) (9)4.4.3. 长期稳定性(Long-Term Stability) (9)4.4.4. 储备液稳定性(Stock Solution Stability) (9)4.4.5. 处理后样品的稳定性(Post-Preparative Stability) (9)4.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (10)5. 生物样品分析测定质量控制(Quality Control) (11)5.1. 分析批(Analytical Batch/Run) (11)5.2. 随行标准曲线(Calibration Curve/Standard Curve) (11)5.3. 质控样品(Quality Control Sample) (11)5.4. 异常值、溢出值的判定与样品重测(Verdiction of Abnormity/Overflow andRepeat Analysis) (12)5.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (12)6. 记录与报告(Documentation) (13)6.1. 总结报告(Summary Infomation) (13)6.2. 方法的建立与确证记录(Method Development and Validation) (14)6.3. 未知样品的分析与质控记录(Application to Routine Drug Analysis) (14)6.4. 其它内容(Other Infomation) (15)7. 参考文献(Reference) (15)生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液或其他组织，具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多以及个体的差异大等特点，因此必须根据待测物的结构、生物介质的特点和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证，并在测定过程中加强质量管理，方可保证研究工作的质量。
1. 常用分析方法(Common Technique)目前常用的几种分析方法有：⑴色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；⑵免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；⑶微生物学方法，可用于抗生素类药物的测定。
生物样本分析方法的选择宜尽量选择可行的灵敏度高的方法。
鉴于本课题组实际设备条件限制，本课题组生物样品分析可选用的方法一般为：高效液相色谱法（紫外检测器）；高效液相色谱－质谱联用法（LC-MS-MS）；气相色谱－质谱联用法（GC-MS）。
2. 方法建立前的准备(Pre-methods Preparation)为保证生物样品测定过程的规范化与结果的可靠性，在方法建立之前对该项目的技术要求、难度、工作量、试验成本及试验时间应该有充分的估计与把握。
因此，在建立方法之前应当进行充分的软件与硬件条件的准备工作，制定相应的工作计划与方案。
方法的准备工作可与分析方法的建立工作同时进行。
2.1. 文献资料的查阅与接收(Literature Preparation)课题组生物样品分析相关课题一般分为三种：临床试验相关课题临床前研究（动物体内生物利用度、药动学与代谢研究）相关课题（横向课题）国家自然科学基金课题或自拟课题（纵向课题）。
前两种课题均为与厂家合作进行研究，因此涉及相关资料交接事宜，如临床试验相关课题的“研究者手册”的交接，均按照国家“药品注册管理办法”及相关技术指导原则的规定项目进行。
若厂家提供的资料不能满足实际准备工作的要求，则需进行详尽的资料查阅工作。
资料查阅工作一般要求对国内外该药物或该类药物的生物样品的分析相关文献进行详细的查阅与整理归类。
一般首先查阅国内相关资料，再查阅国外相关资料，对文献报道的归类整理过程中注意文献报道真实性与合理性的评价。
原则上国内文献选用核心期刊收载文献，国外文献选择MEDLINE或SCI收载期刊文献。
尽量使用国外文献报道作为进行该课题生物样品分析方法建立的参考。
对于纵向课题和自拟课题而言，一般不存在相关单位提供现成的参考资料。
所有的文献资料准备工作均需自己进行。
具体方法与步骤参照上文。
2.2. 试验用参比纯品的准备(Reference Standard Preparation)生物样品分析方法的建立与确证需使用药物或其代谢物的参比纯品，进行标准曲线的建立与质控样品的制备。
试验用参比纯品的纯度直接影响分析结果的准确性，其质量控制是分析方法确证的源头。
因此，方法使用的参比纯品事先需进行完备的鉴别与含量测定，无论购置的还是厂家提供的标准品/对照品/原料药均应向购买方或厂家索取质检报告。
应当尽量使用与待测物结构一致的参比纯品，如条件不允许，可选择使用相关结构与含量确定的化学实体（如酸、碱、盐或酯）。
试验用参比纯品一般有四种来源：⑴国家药品生物制品检定所提供的标准品/对照品；⑵由知名厂商（如SIGMA）提供的市售标准品/对照品；⑶其它厂商提供的具有完备质检证书的原料药；⑷其它分析实验室/化学实验室或非商业机构提供的具有质检证明文件的自合成参比纯品。
购买或获得这些参比纯品时需记录该品的来源、批号、有效期与质检证明，无以上来源信息或质检证明的参比纯品原则上不得用于定量分析的标准曲线建立与质控，但可用作内标。
2.3. 仪器、试剂的准备(Apparatus and Regents Preparation)资料准备工作结束后进入课题的实质准备工作阶段。
首先根据文献资料报道较多的方法进行仪器与试剂的准备工作。
首先根据选定的方法选择需使用的仪器设备，联系仪器设备的负责人协调仪器的使用时间等相关事宜。
若需使用本实验室尚没有的仪器设备，咨询其它课题组或实验室是否有该仪器设备及该设备的具体使用情况。
自己联系或通过课题组负责人联系借用或租用该仪器设备。
如需使用本实验室尚没有的且属本课题组日常工作常用的仪器设备，如条件许可则向课题负责人或实验室负责人申请购买该仪器设备。
购买程序按实验室仪器购置相关管理规定进行。
按照预定的分析方法流程制订课题进行中需使用的试剂清单，查阅实验室相关试剂登记本或咨询实验室试剂管理人员，列出实验室缺少的试剂清单。
制订计划向课题负责人或实验室负责人申请购买，购买程序按实验室试剂购置相关管理规定进行。
2.4. 工作量及试验人员的准备(Workload and Personnel Preparation)根据预定试验计划预计课题的工作量，依据规定课题完成时间及试验操作难度等因素预计需参加本课题的试验人数及试验人员。
根据试验人员试验技能的熟悉程度初步制定试验工作量及工作内容的分配方案。
制订完成后报告课题负责人或实验室负责人。
获得批准后通知相关研究人员熟悉试验的相关内容。
2.5. 课题经费预算(Outlay budget)根据预先拟定的需使用的试剂清单，试验中的必要的耗材的损耗（比如：塑料离心管、移液尖、滤膜、预柱芯、氘灯的损耗、氮气的消耗），仪器的维修费（修理离心机、更换超纯水机的滤芯等）以及试验人员的补贴等，提出试验课题经费预算。
3. 方法确证的分类(Classification of Validation)文献报道的方法一般需进行适当的调整以适应本实验室的实际情况与要求，调整后的方法需进行完整的方法验证。
当对已经验证的方法进行了某些程度的调整之后，应重新考虑需增加哪些新的方法验证内容。
在项目进行的过程中，某一确定的生物样品分析方法往往需要进行不断的调整与验证以适应项目研究的特定要求与目的，保证方法的有效性。
按验证的类型与程度，方法验证一般分为以下三种：3.1. 完整确证(Full Validation)·当第一次建立某种生物样品分析方法时，需进行完整的方法确证工作。
·对于某种新的化学实体的研究需要进行方法的完整确证。
·当已经建立的分析方法中增加了代谢物的分析内容，需调整后的方法进行完整的确证。
3.2. 部分确证(Partial Validation)部分确证为对已经进行完整确证的生物样品分析方法作出调整后进行的确证工作。
部分确证的内容根据方法调整的程度不同而不同，最少可由重新考察准确度与精密度，最多需对调整后的方法进行重新确证。