怎样纯化蛋白质？
❖ 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。
❖ 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
▪ 可溶性：硫酸铵沉淀 ▪ 等电点：离子交换层析 ▪ 分子大小：凝胶过滤层析 ▪ 生物学性质：亲和层析
1. 离子交换层析
❖ 离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。
❖ 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 配比例，达到分离目的的技术。
❖ 固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如 吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的 化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
❖ 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时 称为展层剂。
Then charge of the proteins:
(-)
(-)
(+)
(+)
++
++
++
++
++
Anion exchange column = + charged
++
-+ +
-
+
-++
+
Ion-Exchange chromatography
-
-
+
+
-+
+
+
-
-
+
+
Na+ - Na+ -
Na+ -
蛋白质的分离纯化 与定性定量分析
什么是蛋白质的分离纯化
❖ 分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 ❖ 纯化：得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质？
❖ 研究特定蛋白质的生物学功能（酶、生物活性 蛋白，etc）
❖ 制备抗体 ❖ 蛋白质晶体学研究 ❖ 研究蛋白质-蛋白质相互作用
怎样纯化蛋白质？
❖ 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。
❖ 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 和基团两部分组成。
① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 乙烯苯等高分子聚合物；
② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分为 正电基团和负电基团。
Ion-Exchange chromatography
-
-
+ห้องสมุดไป่ตู้
+
If pH mobile phase =7.2
❖ 如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法 将其分离。
相对离心力/×g 1 000 4 000
15 000 30 000
100 000
时间/min 5 10
20 30
3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞
碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与 其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分 离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。
3. 细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析等
1. 蛋白质的层析分离
层析（chromatography）
❖ chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。
❖层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析，此 后这种方法得到很大的发展。
❖ 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
▪ 可溶性：硫酸铵沉淀 ▪ 等电点：离子交换层析 ▪ 分子大小：凝胶过滤层析 ▪ 生物学性质：亲和层析
蛋白质纯化的基本设计原则
❖ 原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； ❖ 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素，
决定了纯化能否成功）； ❖ 分级分离，先粗后细； ❖ 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
+
+
+
+
+ Na+-Na+
Na+
+
Na+
Na+ -
Na+
Increased salt concentration
Cl- + + Cl-
Cl- +
+ Cl-
+ ClCl- +
基本操作过程
1. 样品制备，装柱与平衡 2. 上样（样品溶解于A液中） 3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰 4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
蛋白质的检测方法
❖ 蛋白质的活性检测方法：必须快，必须是特异 性的
❖ 蛋白质的免疫学检测方法：western-blot，前提 是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
1. 前处理（取决于采用的材料） 动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织 种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂 动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶
❖ 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动 相分次洗脱样品蛋白的方法；
❖ 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 ❖ 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情
况下的首选方案。
分步洗脱
梯度洗脱
2. 凝胶过滤层析
❖ 利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度 不同来分离蛋白质的方法。
❖固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构， 其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶 分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50 的分离范围是1500～30000。
❖ 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等。
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移 动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相 展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层 析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用； 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和 层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。