1. 基因准备2. 实验用鼠的饲养小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。

用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。

供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。

本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。

转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。

这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。

2.1 供体鼠一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。

作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。

一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。

2.2 受体鼠（即假孕母鼠）母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。

这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。

母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。

也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。

一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。

未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。

2.3 结扎公鼠结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。

用作母鼠假孕的结扎公鼠需8周龄以上，对种系无特殊要求。

在作正式实验以前，每只结扎公鼠至少需要和3只母鼠交配，使母鼠只产生阴栓而均不怀孕，方可投入正式实验。

结扎公鼠可每晚与母鼠交配，但最好是隔日一次。

结扎公鼠使母鼠产生阴栓的能力可维持两年。

每只结扎公鼠最好有使母鼠产生阴栓的记录，如经4～6次都不能使母鼠产生阴栓，则所用结扎公鼠必须更换。

如每月作9次显微注射，每次需4～8只假孕母鼠，则需结扎公鼠20只。

2.5 超数排卵3～8周龄供体母鼠在12～14小时光照周期(上午6:00至下午6:00或上午7:00至下午7:00)的动物房内饲养3～5天，即可超数排卵。

一般都采用PMSG 和HCG联合使用进行超排。

用量每只母鼠都为5至7.5国际单位。

一般为冰冻干燥的粉剂，均用生理盐水或PBSG溶解500国际单位／ml，分装于1.5ml离心管中，每管0.1ml，贮存于-20℃，有效期至少一个月。

使用前加0.9ml生理盐水稀释至50IU/ml，每只供体母鼠腹腔注射0.1～0.2ml(即5～10个国际单位)。

PMSG与HCG注射的间隔时间，二者与动物房光照周期关系均影响超排卵效。

一般PMSG与HCG注射间隔46～48小时，排卵发生于注射HCG后10～13小时。

为精确地控制排卵时间，HCG的注射必须在内源LH释放之前。

PMSG 刺激内源LH的释放受动物房光照周期的调节。

内源LH的释放随种系而异，对大多数种系其释放在PMSG注射笫2个暗周期的中点之后16～20小时。

如暗周期是晚6点至早6点，PMSG在下午1～2点注射，46～48小时后注射HCG，这一注射时间约在内源LH释放之前2～3小时。

腹腔注射PMSG后，供体母鼠仍置原笼内，待两日后注射HCG，注射HCG 后每只母鼠置于1个单笼饲养的结扎公鼠笼内，次晨检查阴栓。

3. 小鼠胎儿成纤维细胞培养体系的建立3.1 材料DBA公鼠与C57母鼠配种怀孕13.5d的小鼠胎儿。

细胞培养板(六孔)、低速台式离心机、CO2培养箱、净化工作台、冷冻管、10mL玻璃离心管。

DMEM/F12、胎牛血清。

0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。

细胞培养液：DMEM/F12+FBS(终浓度为10%)+PS。

D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO4 0.05325g+KH2PO4 0.06g+NaHCO3 0.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。

3.2 方法3.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养(消化法)(1)手术取13.5日龄胎儿置于盛有D-Hank`s液的广口瓶中。

(2)用加PS的D-Hank`s液冲洗2~3遍，移入另一个平皿。

(3)去除胚胎的头、四肢、内脏，将剩余部分转移至另一平皿。

(4)将眼科剪将其尽量减碎，加入D-Hank`s液吹打散开，吸去漂浮的脂肪组织等，并吸尽液体。

再吸入适量D-Hank`s液冲洗1遍，再剪，再用D-Hank`s液冲洗，直至冲洗液清亮。

(5)将剪碎的组织放入一10mL玻璃离心管中，再加入约组织量5倍的消化液进行消化，反复吹打。

(6)当溶液出现明显浑浊后，静置一段时间后将上层浑浊液吸入到新的10mL 玻璃离心管中，1500rpm，5min。

(7)去上清，用D-Hank`s液重悬离心2次，1500rpm，5min。

(8)去上清，加成纤维细胞培养液重悬，进行细胞计数，铺六孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

(9)步骤(6)中微小化沉淀物加消化液进行第2次消化，重复步骤(6)- (9)，至步骤不再消化(吹打液不再浑浊)。

3.2.2 小鼠胎儿成纤维细胞的继代培养(1)待培养皿中90%铺满单层细胞时，吸去原有培养液，用D-Hank`s冲洗细胞2次。

(2)加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化处理并置于37℃培养箱直到贴壁的胎儿成纤维细胞基本变圆。

(3)加入成纤维细胞培养液终止消化。

收集细胞混悬液，1500rpm离心5min，除去上清。

(4)用培养液重悬细胞，吸取悬液铺入六孔板中，置37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。

细胞反复消化培养3代至培养孔中杂细胞基本消失。

3.2.3 细胞的冻存与复苏冻存：弃去旧培养液，用D-Hank’s清洗两遍。

加消化液约2min，吹打悬浮细胞，移入离心管，1500rmp，离心3min。

D-Hank’s液洗一遍，弃废液，再用配好的冻存液（含20%FBS，含10%DMSO的DMEM/F12）细胞，加入冻存管中。

-4℃15min，-20℃2h，然后放入-75℃冰箱过夜，最后放入液氮中保存。

复苏：从液氮瓶中取出快速放入37℃中水浴。

融化后加入10倍左右的DMEM/F12培养液，离心（1000rpm/min）10min，去上清，加入培养液，最后稀释使细胞浓度为1×106个/ml。

放置在37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，细胞贴壁后更换培养液。

5. 基因转染胎儿成纤维细胞及细胞株的建立5.1 材料Multiporator（effendorf，德国）、低速台式离心机、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养六孔板、单人双面净化工作台、自动双重纯水蒸馏器、数码凝胶图像处理系统、DNA扩增仪。

DMEM/F12、G418、LUTEOTROPICHormone、Hypoosmolar buffer。

其它试剂为国产分析纯级，分别购自南京科威公司、上海华美公司、上海生工公司、上海药剂等。

0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液：称取0.04gEDTA完全溶解于100mL D-Hank`s液，用1mol/L的NaOH调PH至7.2-7.4，然后称取0.05g胰酶溶解其中，过滤除菌后分装，-20℃保存。

G418筛选培养液：DMEM/F12 100ml+G418 10.000g，过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。

D-Hank`s液：NaCl8g+KCl 0.4g+Na2HPO40.05325g+KH2PO40.06g+NaHCO30.35g，加水至1000mL，调PH=7.2，高压灭菌，4℃保存。

5.2 方法5.2.1 细胞对G418的耐受性实验(1)选择生长均匀、形态正常的细胞消化后，计数。

取两块6孔细胞培养板，的加湿培养箱中向每孔中接种 1ml含2～5×105个细胞的培养液，37℃、5%CO2培养至 50%～70%汇合。

(2)分别向1至8孔中加入 G418。

每孔浓度分别为100µg/ml、200µg/ml、300µg/ml、400µg/ml、500µg/ml、600µg/ml、700µg/ml、800µg/ml。

第9、10、11、12孔作为空白对照。

(3)每两天换培养液一次，每天观察细胞的生长情况并记录。

5.2.2 电转染用电压、脉冲时间的优化电转染时电压和脉冲时间是影响细胞存活率和转染率的最主要因素，许多研究表明，电转染后细胞存活率在50%左右的电学参数就是较为理想的转染参数。

本实验以电压100V、150V、200V、250V和脉冲时间60µs、80µs、100µs、120µs分别电击P3代小鼠胎儿成纤维细胞，电穿孔结束后将电转染液转移至六孔细胞培养板中并补加正常的乳腺上皮细胞培养液后置培养箱中培养24小时，然后消化贴壁细胞计数细胞数，计算出细胞存活率。

5.2.3 基因电转染小鼠胎儿成纤维细胞(1)弃去原培养液，用D-Hank`s液冲洗2遍。

加入0.05%胰酶+0.04%EDTA消化液消化，2min左右后弃去大部分消化液。

(2)待大量细胞变圆时，用含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化。

轻轻吹打分散细胞，并加入1mL左右D-Hank`s液一起移入离心管中。

同时，吸取少量悬液进行细胞计数。

其余的细胞悬液在室温条件下，1500rpm离心5min。

(3)将细胞计数板平放于显微镜台上，立即从计数板边缘轻轻滴加细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。

在镜下观察细胞，根据细胞数量调整细胞密度，使细胞密度达到200个~500个/10mm2。

(4)在显微镜下对细胞进行计数，活细胞胞体完整，透明不着色，凡着色者均为死细胞。

计算四角大方格内的细胞数，压线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。

然后按下列公式计算：细胞数/毫升原悬液=（4大格细胞总数/4）×10000×稀释倍数(5)离心后，弃去上清。

加入1mLHypoosmolar Electroporation Buffer悬浮细胞，1500rpm离心5min，弃上液。

(6)将细胞重悬于Hypoosmolar Electroporation Buffer，使细胞达到1~3×106cells/mL。